BCB染色法筛选牛卵母细胞的初探

论文摘要

亮甲酚蓝（brilliant cresyl blue BCB）是一种生物染料,它可以和卵母细胞中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6DPH）作用而不显色。这种酶在生长中的卵母细胞中含量比较大,随着卵母细胞的生长接近完成,这种物质也逐渐减少,乃至消失。生长期的卵母细胞中含有G6DPH,可以和亮甲酚蓝发生反应而不使卵母细胞着色,而生长完成的卵母细胞中G6DPH很少或接近没有,因此卵母细胞被BCB染成蓝色。被BCB染成蓝色的卵母细胞经体外成熟培养后,具有更好的发育潜能。因此可以通过BCB染色来选择着色的卵母细胞作受体细胞以此来提高核移植的效率。基于此,进行了以下研究:1.研究BCB不同浓度与处理时间对成熟前卵母细胞着色率及成熟率的影响。结果表明,用26、39与52μmol/L的BCB染色后着色率（BCB+着蓝色）（58.5 %、60.3 %、61.4%）显著高于13μmol/L组（9.1%,P<0.05）,但各组间BCB+的成熟率差异不显著（P>0.05）,并且各染色组与对照组卵母细胞的成熟率差异不显著（P>0.05）。用26μmol/L的BCB染色90 min后所得到的着色率（59.3%）显著高于染色60、30 min的着色率（42.6%,26.5%,P<0.05）,但处理时间延长至120min,着色率（60.2%）并没有得到明显的提高。2.研究BCB染色对体外受精（IVM-IVF）的影响。本试验以未进行染色处理的牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）作为对照组,并设置处理对照组（在含有0.5%FBS的D-PBS中放置90 min再放入成熟液）,在成熟培养前用26μmol/L BCB染色90 min作为处理组,将处理组依照胞质的颜色分为蓝色组（BCB+）和无色组（BCB-）。成熟培养后进行体外受精,授精后48 h统计卵裂率,7～8 d后检查囊胚率。结果表明: （1）染色后着色的卵母细胞成熟率（74%）与对照组（71.6%）和无色组（53.4%）差异显著（P<0.05） ; （2） IVF后蓝色组囊胚率（34.1%）较对照组（26.4%）,控制对照组（24%）和无色组（8.7%）差异显著（P < 0. 05）。3.亮甲酚蓝染色法提高核移植囊胚率。将采集的COCs分成三组,对照组:采集后COCs的直接放入成熟液培养,不用BCB处理;处理对照组:COCs于含有0.5%的FBS的D-PBS中90 min后放入成熟液中培养;试验组:将采集的COCs在含有26μmol/L BCB的D-PBS中放置90 min。然后将处理过的卵母细胞根据着色情况分为两组:BCB﹢（胞质呈蓝色,成熟卵母细胞）和BCB-（胞质未着色,生长期卵母细胞）。各组卵母细胞24小时体外成熟培养。分别用成熟后的各组卵母细胞用于细胞核移植,统计体细胞核移植的卵裂数、囊胚数和囊胚细胞数。结果表明BCB+组的囊胚率（41.9%）较对照组、控制对照组和BCB-组的囊胚率（34.9%,36.4%和9.6%）差异显著（P<0.05）。另外BCB+组的囊胚细胞核数（114.5±7.5）较其它组较高,且差异显著（P<0.05）。经囊胚细胞凋亡检测后发现BCB+组的囊胚细胞凋亡率（16.9%）虽显著低于BCB-组（35.9%）,但仍高于对照组（10.4%）和控制对照组（8.5%）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 综述部分
• 第一章 哺乳动物细胞核移植的研究进展
• 1.1 哺乳动物体细胞核移植技术研究概况
• 1.2 我国动物核移植研究成果
• 1.3 哺乳动物细胞核移植程序及相关技术的研究进展
• 1.3.1 细胞的选择与去核
• 1.3.2 供体细胞的选择
• 1.3.3 细胞核的移植
• 1.3.4 重组胚的激活
• 1.3.5 重构胚的培养
• 1.4 影响哺乳动物核移植成功率的因素
• 1.4.1 核受体胞质对核移植的影响
• 1.4.2 供体细胞对核移植的影响
• 1.4.3 融合-激活方案对核移植的影响
• 1.4.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响
• 1.5 细胞核移植技术存在的问题和应用前景
• 1.5.1 细胞核移植技术存在的问题
• 1.5.2 细胞核移植技术的应用前景
• 第二章 哺乳动物卵母细胞体外成熟及发育能力判断的研究进展
• 2.1 卵母细胞成熟的机理
• 2.2 卵母细胞成熟的特征
• 2.3 卵母细胞成熟的判断
• 2.4 卵母细胞的获取与分级
• 2.5 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 2.5.1 卵母细胞的来源
• 2.5.2 成熟培养时间
• 2.5.3 培养基成分
• 2.6 卵母细胞发育能力
• 2.7 卵母细胞发育能力的判定方法
• 2.7.1 形态学判定方法
• 2.7.2 生化及分子生物学判定方法
• 实验部分
• 第三章 亮甲酚蓝染色液对牛卵母细胞体外成熟的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同浓度BCB 染色对牛卵母细胞体外成熟的影响
• 3.2.2 不同时间的BCB 染色对牛卵母细胞着色的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 亮甲酚蓝染色法对牛卵母细胞体外受精的影响
• 4.1 实验材料和方法
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 操作液
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 卵巢和卵母细胞的收集
• 4.2.2 COCs 的染色与体外成熟培养
• 4.2.3 精子的洗涤及体外获能处理
• 4.2.4 卵母细胞的体外受精
• 4.2.5 受精卵的体外培养
• 4.2.6 试验设计
• 4.2.7 数据统计分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 BCB 染色法对牛卵母细胞体外成熟的影响
• 4.3.2 BCB 染色法对牛卵母细胞体外受精的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 亮甲酚蓝染色法筛选卵母细胞对牛体细胞核移植的影响
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 试验用品
• 5.1.2 卵母细胞BCB 染色和体外成熟
• 5.1.3 体细胞核移植供体细胞的制备
• 5.1.4 体细胞核移植
• 5.1.5 囊胚细胞核计数
• 5.1.6 囊胚细胞凋亡染色
• 5.1.7 试验设计
• 5.1.8 统计分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 来源于各组卵母细胞的克隆胚胎发育情况比较
• 5.2.2 BCB 对囊胚细胞凋亡率的比较
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢
• 个人简介