用可调控靶向无肠腺病毒载体携带抗癌基因治疗恶性肿瘤的研究

论文摘要

基因治疗是通过适当设计的载体,将外源基因导入到细胞中进行表达,用以纠正、取代异常基因或杀死异常细胞来治疗疾病,常用于传统医学难于治愈的人类遗传疾病。与一般性遗传疾病相比,起来相对困难些,但是靶向基因治疗癌症仍然是一个重要的方向,关键是如何癌症具有异常基因多,致病机理复杂的特点,因此治疗设计合理的基因载体。无肠腺病毒（gutless adenovirus）载体是将野生腺病毒基因除反向末端重复序列（ITR）和包装信号（Packaging Signal,ψ）外全部缺失,用填充序列替代。它依靠辅助病毒（help virus）提供病毒蛋白,因此又叫依赖辅助病毒的腺病毒（HD-Ad）载体。它与传统腺病毒载体相比,无肠腺病毒载体具有免疫原性小,可插入外源基因片断大,表达时间持久等优点。本论文构建由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子及RU486来靶向调控的无肠腺病毒载体.首先用此载体携带报告基因进行体外细胞实验,发现在端粒酶阳性的肿瘤细胞中,在没有RU486条件下报告基因的表达量几乎检测不到,而在给药（RU486）后表达量明显增加,并且与RU486的浓度和诱导时间有明显的关系。然后用携带抗癌基因Trail的载体,通过在菌株BJ5183中重组构建出GL-Ad-trail重组病毒的质粒,依赖辅助病毒在293Cre4细胞中进行包装及扩增。得到GL-Ad-trail重组病毒后进行体外细胞实验,发现此重组病毒经RU486诱导后能特异性的在肿瘤细胞中激活Caspase-3（胱冬肽酶 3）及Caspase-8而导致细胞凋亡,而对正常细胞则没有影响。该结果说明GL-Ad-trail重组病毒能在肿瘤细胞中特异性表达Trail蛋白,并引起由死亡信号途径介导的细胞凋亡。总之本论文所构建的靶向可调控无肠腺病毒载体的靶向性及可调控性都十分良好,并为下一步开展的双基因靶向可调控及双基因双靶向无肠腺病毒载体的设计提供了一个理想的平台。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 腺病毒载体
• 1.1 无肠腺病毒载体
• 1.2 辅助病毒
• 2 腺病毒载体的靶向可调控系统
• 2.1 GLP65杂合反式基因调控系统（RU486调控系统）
• 2.2 人端粒酶逆转录酶（HTERT）启动子
• 3 细胞凋亡及其信号转导
• 3.1 胱冬肽酶（CASPASE）级联反应及其在凋亡中的作用
• 3.2 信号转导途径
• 第二章 质粒载体的靶向可调控性的研究
• 1 实验材料
• 1.1 菌株工具酶及试剂
• 1.2 细胞株
• 1.3 质粒
• 1.4 病毒
• 2 实验方法
• 2.1 HTERT启动子（-378- +78）的克隆及序列测定
• 2.2 端粒酶活性测定
• 2.3 报告基因的分析
• 2.4 质粒PRS-17的改造
• 2.5 PRS-HTERT载体的构建
• 2.6 PRS-HTERT载体萤火虫荧光素酶基因的靶向可调控分析
• 2.7 PRS-HTERT载体受RU486诱导表达外源基因TRAIL的定量分析
• 3 结果
• +78的鉴定结果'>3.1 HTERT启动子-378⁺78的鉴定结果
• 3.2 端粒酶活性的肿瘤特异性
• 3.3 HTERT启动子的肿瘤专一性
• 3.4 PRS-HTERT载体携带LUCIFERASE在各种细胞中的靶向可调控表达
• 3.5 PRS-HTERT载体受RU486诱导表达外源基因TRAIL的定量分析
• 4 讨论
• 第三章 携带TRAIL基因的无肠腺病毒治疗肿瘤
• 1 实验材料
• 1.1 质粒及工具酶
• 1.2 菌株
• 1.3 细胞培养
• 1.4 病毒
• 2 实验方法
• 2.1 载体PRS-HTERT的构建
• 2.2 穿梭质粒PLSH的构建
• 2.3 无肠腺病毒包装质粒PGL-HTERT／TRAIL的构建
• 2.4 无肠腺病毒的包装及小规模扩增
• 2.5 病毒GL-AD-HTERT／TRAIL的鉴定
• 2.6 病毒的大量制备与CSCL密度梯度离心纯化病毒
• 2.7 无肠腺病毒的滴度及纯度测定
• 2.8 GL-AD-TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的检测
• 3 结果
• 3.1 病毒包装质粒的构建
• 3.2 病毒CSCL密度梯度离心纯化
• 3.3 病毒DNA的鉴定
• 3.4 GL-AD-TRAIL感染肿瘤细胞能引起细胞凋亡，但对正常细胞没有影响
• 3.5 GL-AD-TRAIL在肿瘤细胞7404中引起凋亡信号通路上的相关蛋白的表达
• 3.6 流式细胞仪检测GL-AD-TRAIL引起的肿瘤细胞7404的凋亡
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢