神经胶质细胞谷氨酸—谷氨酰胺循环在福尔马林诱导脊髓中枢敏化中的作用

论文摘要

研究背景：脊髓背角神经胶质细胞在外周组织损伤和或炎症而激活，并参与形成和维持痛觉过敏，触诱发痛，以及持续性痛等神经病理痛的中枢敏化过程，其中谷氨酰胺发挥了重要的作用。然而目前多数研究主要关注的是在外周炎症或神经损伤下小胶质细胞和星形胶质细胞被激活的机制，以及神经胶质细胞与神经元间的信息传递过程，而对神经胶质细胞内的分子机制则很少涉及。目前更多证据揭示胶质细胞具备给神经元传递神经递质谷氨酰胺的功能，因此在中枢敏化中起到重要作用。谷氨酸-谷氨酰胺循环主要存在于星形胶质细胞，包括移除突触间隙内的谷氨酸和GABA，而另外一个主要功能则是合成谷氨酰胺（是谷氨酸和GABA的重要的前体物质）。中枢神经系统中的谷氨酰胺主要来源于胶质细胞，其产生受限于胶质细胞的谷氨酰胺合成酶反应。神经胶质细胞内“谷氨酸-谷氨酰胺循环”在三叉神经尾核中枢敏化中作用的研究提示了胶质细胞谷氨酰胺合成酶参与了三叉神经尾核感受伤害神经元中枢敏化的过程。然而，类似的研究在脊髓中枢敏化中的作用并未涉及，其下游的谷氨酰胺重摄取神经元转运系统-A转运系统在脊髓中枢敏化过程中的作用更是空白区。我们推测，在炎性持续性痛及神经病理痛的形成和维持过程中，脊髓神经胶质细胞很可能参与该过程的形成，途经则可能是通过神经胶质细胞内的“谷氨酸-谷氨酰胺循环”改变了脊髓背角伤害感受性神经元的突触功能，进而影响伤害感受性神经元的痛传导和痛控制活动来实现的。但是，这一假设尚缺乏机能学和形态学的直接证据。因此对神经胶质细胞内谷氨酸-谷氨酰胺循环的研究，可以为神经胶质细胞参与炎性持续性痛及神经病理痛的形成和维持机制提供机能学和形态学证据，为痛感觉和痛调制理论提供新的理念，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。目的：本研究旨在观察大鼠后肢福尔马林诱发痛觉过敏试验中，通过鞘内注射MSO-谷氨酰胺合成酶抑制剂，观察谷氨酸—谷氨酰胺循环在脊髓星形胶质细胞中枢敏化的作用。方法：第一部分：动物行为学试验。大鼠随机分为6组，每组6只：鞘内注射PBS+5％福尔马林组；鞘内注射MSO+5％福尔马林组；鞘内注射“MSO+GLN”+5％福尔马林组；SHAM（仅行鞘内插管）+5％福尔马林组；鞘内注射GLN+5％福尔马林组；空白对照（无干预措施）+5％福尔马林组。观察大鼠后肢注射福尔马林舔咬爪时间（seconds）和每分钟抬腿次数（Hz），每间隔5分钟记录一次，连续60分钟。第二部分：免疫组化试验。灌注5组大鼠，分别鞘内注射PBS+5％福尔马林组；鞘内注射MSO+5％福尔马林组；鞘内注射“MSO+GLN”+5％福尔马林组；空白对照+5％福尔马林组，SHAM+5％福尔马林组，除外GLN+5％福尔马林组（GLN在第一部分试验中证明对福尔马林炎性痛无易化作用），利用免疫荧光双标记技术，观察鞘内注射MSO后，GS及GFAP（glial fibrillary acidic protein，星形胶质细胞特异性标记物）在腰段脊髓的表达和分布是否减弱以及鞘内注射Gln后，观察GS、GFAP表达水平是否恢复到正常水平或有所增强。结果：第一部分：1、注射5％福尔马林炎性痛反应呈现经典的双时相反应，第一时相注射后立即出现明显疼痛反应，舔咬爪时间及抬腿次数增多并持续5分钟；第二时相在度过5—10分钟静息期后疼痛反应增强并持续到40—50分钟。2、鞘内注射MSO明显减少了福尔马林注射诱导伤害性行为舔／咬时间（MSO 0.1 mM，50 ul：F（1，143）=15.717，p＜0.05）；在鞘注MSO组观察60分种内舔咬爪时间比空白组明显缩短，在其中4个时间点上差异有统计学意义（p＜0.05）。鞘注MSO组观察60分种内舔咬爪时间在25—40分钟之间比PBS组明显缩短，其差异有统计学（p＜0.05）。Two-way RM-ANOVA分析为三组不同方式处置因素（F（2，215）=8.53，P=0.007），不同时间点因素（F（11，215）=7.58，P＜0.001），不同时间及处置方式两种因素交互作用（F（22，215）=2.23，P=0.003），结果显示均有统计学意义。同样，鞘内注射MSO明显减少了福尔马林诱导炎性痛60分钟内抬腿次数，PBS组为3.825±0.54 Hz，MSO组为1.692±0.23 Hz（F（1，143）=25.568，p=0.004），结果显示有统计学差异。3、鞘内同时注射MSO+GLN（50 ul，0.25 mM）可以反转福尔马林注射诱导伤害性行为，鞘注MSO+GLN组观察60分种内舔咬爪时间30min．35min，40min等时间点上比MSO组明显延长，其差异有统计学（p＜0.05），而与PBS组中的各时间点上差异无统计学意义（p＞0.05）。同样这种抑制效应又同样抬腿实验中有所表现，在同时鞘内注射MSO与GLN组中的抬腿次数（3.355±0.29Hz）明显比MSO组（1.692±0.23 Hz）增多（F（1，143）=27.729，t=4.072，P＜0.05），差异有统计学意义。然而PBS组的抬腿次数（3.825±0.54 Hz）与MSO与+GLN组差异无统计学意义（3.355±0.29 Hz t=1.15，p=0.83）。第二部分：免疫荧光双标记实验部分，1、鞘内注射MSO后，大鼠痛模型GS、GFAP在脊髓腰段背角的表达减弱（P＜0.05）；2、鞘内注射MSO+Gln后，GS、GFAP及GS与GFAP的脊髓腰段背角的表达增强或恢复到基础水平（P＜0.05），并显示GS及GFAP共表达的情况。3、空白组、SHAM组、MSO+GLN组与PBS组的GS、GFAP在脊髓腰段背角的表达无明显改变（P＞0.05）。结论：星形胶质细胞与神经元中谷氧酸—谷氧酰胺循环参与大鼠福尔马林诱导的中枢敏化作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验原理
• 二、实验动物及准备
• 三、主要试剂及配置方法
• 四、主要仪器和设备
• 五、实验设计
• 六、大鼠鞘内插管术
• 七、大鼠炎性痛模型制备
• 八、大鼠实验分组与注药
• 九、灌注、固定、取材
• 十、切片
• 十一、免疫双标
• 十二、统计学处理
• 结果
• 第一部分 行为学研究
• 第二部分 免疫组化研究
• 讨论
• 一、胶质细胞与疼痛调控机制
• 二、谷氨酸-谷氨酰胺循环在疼痛中的机制
• 三、谷氨酸-谷氨酰胺循环在脊髓胶质细胞中的作用机制
• 四、小结
• 五、展望
• 六、结论
• 参考文献
• 综述
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 致谢