红景天苷纳米脂质体的研制

论文摘要

红景天中的主要活性成分红景天苷具有良好的保健作用,已经应用于医药、食品、化妆品等领域。但开发红景天苷的保健产品仍存在提取效率低、产品纯度低和体内生物利用度低等问题。本文系统研究了红景天苷的提取分离纯化工艺;制备了红景天苷纳米脂质体,研究其物化稳定性;并进一步制备了红景天苷前体脂质体,研究其复水效果和贮藏稳定性;建立了红景天苷纳米脂质体的体外释放模型;研究了红景天苷纳米脂质体的抗辐射功能,探讨了红景天苷纳米脂质体在小鼠体内的组织分布和口服吸收动力学。首先,采用微波辅助提取的方法提取红景天苷,结果表明微波功率为130 W,20%（v/v）乙醇作提取溶剂,固液比为1:29（g/mL）,微波辐照时间60 s时,红景天苷的一次提取率达到80%。与传统的乙醇回流法相比,微波1 min提取两次和采用传统乙醇加热回流120min提取四次的结果基本相同。采用大孔吸附树脂和超滤膜分离纯化红景天苷,结果表明DA201大孔吸附树脂对红景天苷有良好的吸附选择性,静态饱和吸附容量和动态吸附容量分别为21.88和13.25 mg/mL,通过柱层析实验确定了DA201树脂分离红景天苷的工艺,经50%乙醇一步洗脱可将红景天苷的纯度从3.8%提高到13.8%。超滤结果表明最佳超滤条件为压力0.05 MPa,温度40℃,提取液稀释倍数3倍,得到的红景天苷产品纯度较高,使用截留相对分子质量为10000和3000的超滤膜,红景天苷得率分别为86.2%和80.4%,红景天苷的纯度分别可达到30.65%和38.72%,满足工业化生产的需要。采用薄膜法、冻融法、反相蒸发法、超声法、熔融法制备了红景天苷纳米脂质体。结果表明,红景天苷纳米脂质体的包封率依次为:冻融法＞薄膜法＞反相蒸发法＞熔融法＞超声法;红景天苷载量显著影响脂质体的包封率、粒径分布和zeta电位大小;超声法、熔融法和反相蒸发法制备的红景天苷纳米脂质体具有较好的分散性,PDI较低。红景天苷纳米脂质体的渗漏结果表明渗漏与时间的平方根呈线性关系,渗漏具有扩散特征。熔融法制备的红景天苷纳米脂质体显示较低的渗漏率,4℃和30℃下贮藏一个月的渗漏率分别为10%和15%。冻融法和薄膜法制备的红景天苷纳米脂质体在4℃和30℃下的物化稳定性最差,聚集现象严重;熔融法制备的红景天苷纳米脂质体4℃和30℃下经过180天的贮藏之后粒径能够保持基本不变。通过与空白脂质体的比较发现,红景天苷能够提高脂质体的稳定性。结果还表明红景天苷纳米脂质体的稳定性是空间稳定的结果。采用乙醇注入法制备红景天苷纳米脂质体,结果显示红景天苷载量5%,胆固醇/磷脂质量比1:4,Tween80/磷脂摩尔比1:2,离子强度20-50 mmol/L,水合温度50℃,水合时间30 min,超声功率280W,制备的红景天苷纳米脂质体包封率较高,粒径小于100 nm,zeta电位为-10到-20 mV。体外释放结果表明,模拟胃液或肠液中24 h后,红景天苷累积释放率为60%,缓释效果明显。以红景天苷的包封率和一个月后的渗漏率为主要指标,进一步采取正交实验优化工艺条件。结果得到,胆固醇/磷脂比例为1:5,磷脂浓度1%,Tween80/磷脂摩尔比1:2,水合介质离子强度50 mmol/L的最佳工艺条件,制备的红景天苷纳米脂质体包封率为45.6%,一个月后的渗漏率为8.5%,粒径为147.6 nm,zeta电位为-12.5 mV。红景天苷纳米脂质体的物理稳定性结果表明,4℃和30℃条件下经过180天的贮藏之后,红景天苷纳米脂质体粒径分别增加21%和250%。AFM结果显示贮藏过程中红景天苷纳米脂质体粒径不断增大,形态变化。红景天苷纳米脂质体的化学稳定性研究结果表明,MDA含量持续上升和pH值持续下降,温度越高变化趋势越大。通过实验筛选出甘露醇为最佳的冻干保护剂,成功制备红景天苷前体脂质体。甘露醇/磷脂质量比20:1,红景天苷前体脂质体外观饱满、致密,复水水合之后的包封率达到40%以上,包封率的保留率达到90%,粒径为223.9 nm,与红景天苷纳米脂质体粒径190.1 nm的结果十分接近。FTIR红外光谱分析显示磷脂极性头基和甘露醇的确发生了相互作用,形成氢键,起到了保护脂质体膜完整性的作用。红景天苷前体脂质体的贮藏稳定性结果表明,20℃或40℃条件下贮藏60天,外观、粒径、包封率、pH值、MDA等指标基本保持稳定。吸湿增重结果提示红景天苷前体脂质体贮藏过程中应尽量避免高湿。针对红景天苷纳米脂质体体系,建立了简单、适用,能够描述红景天苷纳米脂质体释放性能的模型。模型预示了红景天苷分子在起始阶段具有突释现象,综合分析了突释同胆固醇和Tween80用量,以及红景天苷载量等制备因素之间的关系。对实验数据进行了模型参数的拟合,通过不同的释放速率和模型参数的比较,揭示了胆固醇和Tween80用量,以及红景天苷载量等制备因素同释放性能之间的一些基本规律。小鼠X射线亚急性和亚慢性辐射损伤防护实验表明,红景天苷纳米脂质体对小鼠亚急性和亚慢性辐射损伤具有良好的防护作用。小鼠体内组织分布结果显示,红景天苷纳米脂质体对组织的亲和力增强,改变了在组织中的分布,对肝、脑等特定的组织具有一定的富集效果。药代动力学结果表明,红景天苷纳米脂质体相对于红景天苷提取液在体内有较长的滞后时间和较低的清除率,释放更为缓慢,延长了有效作用时间。因此,红景天苷纳米脂质体的生物利用度得到了增加,纳米脂质体是一种能够提高红景天苷生物有效性的优良载体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略符号表
• 第一章 绪论
• 1.1 红景天
• 1.1.1 红景天植物概述
• 1.1.2 红景天的主要成分
• 1.2 红景天苷
• 1.2.1 红景天苷的理化性质
• 1.2.2 红景天苷的药理学性质
• 1.3 红景天苷产品的研究进展
• 1.3.1 红景天苷产品的现状
• 1.3.2 红景天苷的国内外研究进展
• 1.3.2.1 红景天苷的提取方法
• 1.3.2.2 红景天苷的分离纯化
• 1.3.3 存在问题
• 1.4 脂质体
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 国内外脂质体的研究进展
• 1.4.2.1 脂质体的制备方法
• 1.4.2.2 脂质体在医药工业和化妆品中的应用
• 1.4.2.3 脂质体在食品工业中的应用
• 1.5 本课题立题背景和意义
• 1.6 本课题的主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 红景天苷的微波辅助提取及分离纯化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 红景天苷标准曲线的制作
• 2.2.2.2 红景天苷含量的测定
• 2.2.2.3 红景天苷纯度的测定
• 2.2.2.4 鞣质的测定
• 2.2.2.5 蛋白的测定
• 2.2.2.6 总酚的测定
• 2.2.3 红景天苷的MAE和乙醇回流法
• 2.2.3.1 MAE的方案设计
• 2.2.3.2 乙醇回流提取
• 2.2.3.3 数据统计分析
• 2.2.4 大孔吸附树脂纯化
• 2.2.4.1 树脂的预处理
• 2.2.4.2 静态吸附平衡实验
• 2.2.4.3 解吸实验
• 2.2.4.4 动态吸附与洗脱
• 2.2.5 红景天苷的超滤工艺
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 红景天苷的MAE
• 2.3.1.1 MAE模型的建立与统计分析
• 2.3.1.2 单因子效应分析
• 2.3.1.3 交互作用分析
• 2.3.1.4 MAE和乙醇回流法的比较
• 2.3.2 红景天苷的大孔吸附树脂分离纯化
• 2.3.2.1 大孔吸附树脂的筛选
• 2.3.2.2 静态吸附性能
• 2.3.2.3 动态吸附与洗脱
• 2.3.3 红景天苷的超滤
• 2.3.3.1 温度对膜通量的影响
• 2.3.3.2 压力对膜通量的影响
• 2.3.3.3 浓度对膜通量的影响
• 2.3.3.4 超滤对红景天苷提取效果的影响
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 红景天苷纳米脂质体的制备及其物理化学性质的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 红景天苷的提取与纯化
• 3.2.2.2 红景天苷纳米脂质体的制备
• 3.2.2.3 红景天苷含量的测定
• 3.2.2.4 红景天苷包封率的测定
• 3.2.2.5 脂质体zeta测定
• 3.2.2.6 脂质体粒径分布的测定
• 3.2.2.7 脂质体形态结构观察
• 3.2.2.8 渗漏率测定
• 3.2.2.9 数据统计分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同制备方法和红景天苷载量的影响
• 3.3.2 红景天苷纳米脂质体的形态结构
• 3.3.3 红景天苷纳米脂质体的粒径分布
• 3.3.4 脂质体的zeta电位
• 3.3.5 红景天苷纳米脂质体的渗漏特性
• 3.3.6 红景天苷纳米脂质体的温度—稳定性
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 乙醇注入法制备红景天苷纳米脂质体及其前体脂质体的研制
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与设备
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 红景天苷纳米脂质体的制备
• 4.2.2.2 红景天苷含量的测定
• 4.2.2.3 红景天苷包封率的测定
• 4.2.2.4 脂质体zeta测定
• 4.2.2.5 脂质体粒径分布的测定
• 4.2.2.6 浊度测定
• 4.2.2.7 模拟体外释放实验
• 4.2.2.8 纳米脂质体渗漏率测定
• 4.2.2.9 红景天苷前体脂质体的制备
• 4.2.2.10 红景天苷前体脂质体的重建水合
• 4.2.2.11 原子力显微镜
• 4.2.2.12 红景天苷前体脂质体FTIR分析
• 4.2.2.13 红景天苷前体脂质体吸湿性的测定
• 4.2.2.14 丙二醛（MDA）含量的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 乙醇注入法的单因素实验
• 4.3.1.1 红景天苷载量和磷脂浓度对脂质体包封率的影响
• 4.3.1.2 胆固醇对红景天苷纳米脂质体包封率和粒径分布的影响
• 4.3.1.3 非离子表面活性剂Tween80的影响
• 4.3.1.4 水合介质pH值和离子强度的影响
• 4.3.1.5 乙醇用量的影响
• 4.3.1.6 水合温度和时间的影响
• 4.3.1.7 超声功率的影响
• 4.3.2 红景天苷纳米脂质体的zeta电位
• 4.3.3 红景天苷纳米脂质体的体外模拟释放
• 4.3.4 乙醇注入法的工艺优化
• 4.3.5 红景天苷纳米脂质体的贮藏稳定性
• 4.3.5.1 粒径变化
• 4.3.5.2 渗漏率特性
• 4.3.5.3 化学稳定性
• 4.3.6 红景天苷前体脂质体的制备和性质
• 4.3.6.1 冻干保护剂的选择
• 4.3.6.2 红景天苷前体脂质体外观形态
• 4.3.6.3 冻干保护剂对红景天苷前体脂质体复水后包封率的影响
• 4.3.6.4 冻干保护剂对红景天苷前体脂质体复水后粒径分布的影响
• 4.3.6.5 红景天苷前体脂质体的FTIR分析
• 4.3.6.6 红景天苷前体脂质体的贮藏稳定性
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 红景天苷纳米脂质体的释放机理研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料与设备
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 红景天苷纳米脂质体的制备
• 5.2.2.2 红景天苷浓度的测定
• 5.2.2.3 红景天苷包封率的测定
• 5.2.2.4 体外释放实验
• 5.3 结果与讨论:
• 5.3.1 模型假设
• 5.3.2 模型的建立
• 5.3.3 不同模型对红景天苷纳米脂质体释放的拟合及比较
• 5.3.3.1 Higuchi模型
• 5.3.3.2 一级动力学经验模型
• 5.3.3.3 新建立释放模型
• 5.3.4 模型参数的影响
• 5.3.4.1 胆固醇用量对红景天苷纳米脂质体扩散特征的拟合
• 5.3.4.2 Tween80对红景天苷纳米脂质体扩散特征的拟合
• 5.3.4.3 红景天苷载量对红景天苷纳米脂质体扩散的影响
• 5.3.4.4 不同释放介质对红景天苷纳米脂质体扩散的影响
• 5.3.5 红景天苷纳米脂质体释放过程中的突释
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 红景天苷纳米脂质体对X射线辐射损伤防护的研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 主要仪器
• 6.2.2 试剂及其配制
• 6.2.2.1 主要试剂
• 6.2.2.2 主要试剂的配制
• 6.2.3 红景天苷纳米脂质体的制备
• 6.2.4 小鼠亚急性辐射防护实验
• 6.2.4.1 动物模型
• 6.2.4.2 检测指标和方法
• 6.2.5 体内亚慢性辐射防护作用实验
• 6.2.5.1 动物模型
• 6.2.5.2 检测指标和方法
• 6.2.6 红景天苷纳米脂质体的药代动力学研究
• 6.2.6.1 实验设计
• 6.2.6.2 红景天苷体内HPLC分析方法的建立
• 6.2.5.3 药代动力学数据处理
• 6.2.7 数据处理
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 亚急性辐射的防护实验
• 6.3.1.1 外周血象的影响
• 6.3.1.2 巨噬细胞吞噬能力的影响
• 6.3.1.3 免疫脏器指数的影响
• 6.3.1.4 肝和脾组织中SOD、MDA、GSH-Px的影响
• 6.3.1.5 骨髓细胞DNA的影响
• 6.3.1.6 外周血淋巴细胞转化的影响
• 6.3.1.7 外周血淋巴细胞凋亡的影响
• 6.3.2 亚慢性辐射的防护实验
• 6.3.2.1 体重和免疫脏器指数的影响
• 6.3.2.2 外周血象的影响
• 6.3.2.3 脾淋巴细胞转化率的影响
• 6.3.2.4 肝组织SOD、MDA和GSH-Px活性的影响
• 6.3.2.5 精子畸变率的影响
• 6.3.2.6 骨髓细胞凋亡的影响
• 6.3.3 红景天苷纳米脂质体在小鼠体内组织的分布
• 6.3.4 红景天苷纳米脂质体的药代动力学
• 6.3.5 红景天苷纳米脂质体对辐射防护的机理探讨
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 论文创新点
• 攻读博士期间发表的论文成果
• 致谢