利用多重荧光SSR标记构建甘蓝型油菜品种的DNA指纹图谱

论文摘要

油菜品种DNA指纹数据库的构建在油菜品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值,对理清我国油菜种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。本课题基于毛细管凝胶电泳和荧光SSR标记,建立了一套高通量油菜品种SSR检测体系,为大规模油菜品种鉴定和大规模油菜DNA指纹图谱的构建奠定了基础。本论文以SSR标记为技术手段,对多重PCR体系建立的基本过程及荧光标记多重PCR组合的确定等油菜DNA指纹库构建的关键技术环节进行了研究。本论文形成如下研究结果：（1）根据本实验室已构建的甘蓝型油菜高密度遗传连锁图谱以及之前的引物筛选结果,初步挑选出52对多态性高、扩增质量好的SSR引物。将左右引物5’端分别加上M13F和M13R接头,通过聚丙烯凝胶电泳检测发现其中24对引物扩增效果较好,可入选多重PCR组合。同时记录各产物间的相对大小关系。（2）对入选的引物进行多重PCR组合,探讨了多重PCR构建的基本过程。采用6-FAM和HEX荧光染料标记上游通用引物M13F,通过调整PCR体系中各反应成分的量和反应条件,最终确定了一套完整的多重PCR扩增和检测体系。在ABI3500 Genetic Analyzer上对扩增产物进行电泳分析,GeneMapper 4.1软件分析产物片段大小并进行分型。（3）本实验以筛选到的16对SSR引物对179份油菜进行基因分型。16对SSR引物分别检测到2-9个等位变异,共检测到78个等位变异,平均每对引物检测到4.88个等位变异,各引物的PIC值分别为0.35-0.97,平均为0.82。聚类分析显示该供试品种的遗传多样性相对狭窄。（4）根据多重PCR组合的结果,结合PIC值和鉴别力,确定核心引物组合,构建179份甘蓝型油菜品种的指纹图谱。最后用9对SSR引物构建了179个甘蓝型油菜品种的指纹图谱。利用核心引物组合扩增的方法,可以鉴定油菜杂交组合及其亲本的真实性和纯度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 油菜种质资源
• 1.2 遗传标记技术的发展
• 1.2.1 形态学标记
• 1.2.2 细胞学标记
• 1.2.3 生化标记
• 1.2.4 分子标记
• 1.2.4.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 1.2.4.2 随机扩增多态性（RAPD）
• 1.2.4.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.2.4.4 简单序列重复（SSR）
• 1.2.4.5 单核苷酸多态性（SNP）
• 1.3 DNA分子标记的应用
• 1.4 多重PCR
• 1.4.1 多重PCR技术原理
• 1.4.2 多重PCR的应用
• 1.5 DNA指纹图谱
• 1.5.1 DNA指纹图谱的原理
• 1.5.2 DNA指纹图谱的应用
• 1.5.3 油菜DNA指纹图谱研究现状
• 1.6 本课题研究的目的与意义
• 1.7 本课题研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 取样
• 2.2.2 DNA的提取
• 2.2.3 分子内标的制备
• 2.2.3.1 目标序列的扩增
• 2.2.3.2 DNA片段的回收、克隆
• 2.2.3.3 感受态细胞的电击转化
• 2.2.3.4 质粒的提取、检测和测序
• 2.2.4 荧光标记多重PCR扩增流程
• 2.2.5 电泳检测
• 2.2.5.1 PAGE检测与记录
• 2.2.5.2 毛细管凝胶电泳检测
• 2.2.6 引物设计
• 2.2.7 荧光标记多重PCR体系的构建与优化
• 2.2.8 多态性分析
• 2.2.9 聚类分析
• 2.2.10 DNA指纹图谱的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 荧光标记多重PCR体系的构建与优化
• 3.2 引物筛选及多态性分析
• 3.3 179份甘蓝型油菜品种的聚类分析
• 3.4 DNA指纹图谱的构建
• 3.4.1 SSR标记分析及品种鉴别
• 3.4.2 核心引物组合
• 3.4.3 179份油菜品种的DNA指纹图谱
• 4 讨论
• 4.1 荧光标记多重PCR技术的优越性及存在问题
• 4.2 品种鉴定及核心引物的挑选
• 4.3 DNA指纹图谱构建
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 备选SSR核心引物序列信息
• 附录2 179份油菜品种（系）的DNA指纹图谱