论文摘要
肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一,寻找有效的抗肿瘤药物与方法是当今世界医学界的重要研究课题。研究表明,许多中药具有抗肿瘤作用,但其作用成分复杂,具有多种作用成分和通过多种作用途径产生抗肿瘤作用。弄清中药的抗肿瘤作用途径和靶位点对加速抗肿瘤中药的开发具有重要意义。近50年来尽管肿瘤治疗取得了一些进展,化疗、放疗、手术仍是治疗基本手段。但是由于现有的化疗药物和放疗的选择性不高,杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内正常细胞,治疗中常出现较明显的毒副反应,研究、开发一种对肿瘤细胞选择性高、杀伤作用强且对正常组织副作用小的抗肿瘤药物非常有意义。免疫毒素是提高治疗效果的一条重要途径,也是新一代的癌症治疗方法,此疗法与传统的化疗不同,其药物能在肿瘤部位有相对较高的浓度,存留较长时间,对肿瘤靶细胞有较强的杀伤活性,而对正常细胞无作用或毒性很小。免疫毒素是靶向性治疗肿瘤的代表性药物,也是当前免疫学研究的热点之一,被称为“生物导弹”。近年来,利用基因工程技术构建了许多不同用途的免疫毒素。免疫毒素是具有导向能力的分子（载体）和具有细胞毒性的分子（毒素）构成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。载体一般由抗体、细胞因子和激素等组成,毒素一般为来自于细菌或植物。载体可以把毒素定向带到病灶部位,将癌细胞或病变细胞杀死,减少了对正常细胞的杀伤。研究表明,免疫毒素在体内具有靶向性,使毒素更易于与肿瘤细胞结合,大大提高了毒素对肿瘤细胞的杀伤率,降低了其对正常细胞的毒副作用。人表皮生长因子（human epidermal growth factor,EGF）是一种通过受体起作用刺激细胞增殖和分化的重要生长因子,很多肿瘤尤其是实体瘤细胞表面有异常高水平的EGF受体表达;天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是一种自然存在的植物单链毒素,具有抑制肿瘤生长的作用。KDEL是一段高疏水的序列,它曾应用于PE毒素的C末端可以显著的提高PE杀伤肿瘤细胞的活性。本研究旨在利用EGF的靶向性和TCS蛋白的细胞毒性,将KDEL序列应用于TCS的C末端以提高TCS的活性,在分子水平设计合成一个融合蛋白,使其具有组成部分各自的生物学功能,即能够靶向性杀伤肿瘤细胞,有利于临床肿瘤的治疗。首先使用PCR方法扩增EGF-Linker-TCSKDEL基因片段,双酶切后插入表达载体Pet28a中,表达了EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白,使用亲合层析纯化了EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白。接下来,我们研究评估了EGF-Linker-TCSKDEL的生物活性,并进一步探索了其抑制肿瘤细胞生长的作用机制。1.首先,我们检测了EGF-Linker-TCSKDEL对各种肿瘤细胞和正常细胞的抗增殖作用。选择对数生长期的细胞,（4～5）×105/mL的悬液细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后用含10%小牛血清的培养液配成单细胞溶液,细胞直接以4×104/ml接种于96孔板100μl/孔;细胞贴壁后,添加含不同浓度目的蛋白的同样培养基100μl/孔,对照组（0ng/ml融合蛋白）12个平行孔,融合蛋白每个剂量组设6个平行孔,继续培养48h。吸弃培养基,加含MTT 0.5mg/ml的PBS（PH6.8）100μl/孔,培养4h后,快速翻板法除去PBS,加二甲基亚砜100μl/孔,微量振荡仪振荡5min,用酶标仪570nm测定各孔吸光度值（OD值）。细胞种板、融合蛋白的加入同MTT法。融合蛋白加入后48h,加BrdU标记溶液20μl/孔,继续培养18h。吸弃标记培养基,加固定溶液200μl/孔,室温孵育30min。快速翻板法除去固定溶液,并将培养板倒扣于滤纸上吸干残余固定液后,加抗BrdU-POD工作溶液室温孵育90min。吸弃抗体偶联溶液,用清沈溶液200μl/孔×3洗板后,加底物溶液100μl/孔,室温孵育10min,加1M H2SO425ul/孔阻止反应,微板读数仪450nm测吸光度值（A值）。细胞生长抑制率按下列公式计算:生长抑制率=（（正常对照组A值-用药组A值）/正常对照组A值）×100%结果表明:EGF-Linker-TCSKDEL对肿瘤细胞和正常细胞都具有一定的生长抑制作用,但对肿瘤细胞的抑制作用要远远大于对正常细胞的生长抑制作用。MTT法检测其对人肺腺癌A549,人肝癌HepG2和人正常肝L02细胞的IC50分别为2.53μg/ml、5.56μg/ml和大于100μg/ml。2.接着,我们应用流式细胞仪研究检测EGF-Linker-TCSKDEL是否可以诱导肿瘤细胞的凋亡。培养细胞、分组。然后加入药物作用3小时后收集细胞。收集各组细胞于离心管中,离心后用冰冷的PBS洗细胞2次弃去上清液;将细胞沉淀重悬于70%乙醇（用PBS稀释）500μl的PBS中,固定细胞30min以上。离心后,弃上清。留下约50μl细胞悬液加10μl的RNase即RNA酶（10mg/ml）。37℃水浴30min。加PBS约300μl后加入碘化丙啶（终浓度20μg/ml）染色,室温下避光15min,200目滤网过滤后,研究结果表明,EGF-Linker-TCSKDEL（0.5,1,2,4μg/ml）作用肿瘤细胞3小时具有诱导A549细胞凋亡的作用,凋亡率分别为:6.9%、11.7%、22.1%,39.8%;融合蛋白能明显抑制细胞S期的合成,流式细胞仪检测将肿瘤细胞增殖阻滞在DNA合成的S期。3.随后我们进行了整体动物抗肿瘤实验。EGF-Linker-TCSKDEL对小鼠的半数致死剂量(LD50)为:雄性734.52μg/kg,雌性733.31μg/kg。肿瘤接种:常规培养A549肺癌细胞,用生理盐水稀释为5×106个/ml,以0.2ml/只接种于小鼠右侧腋窝皮下。分组与给药:将接种肿瘤后的小鼠按体重分为5组,每组5只。①肿瘤对照组:尾静脉注射生理盐水;②融合蛋白高剂量组:尾静脉注射100μg/kg/d;③融合蛋白中剂量组:尾静脉注射50μg/kg/d;④融合蛋白低剂量组:尾静脉注射25μg/kg/d:⑤环磷酰胺组:腹腔注射环磷酰胺100mg/kg/d;各组均于肿瘤接种后次日开始给药,注射容积为0.1ml/10g,每日1次,连续14d,阳性对照药环磷酰胺隔日腹腔注射一次。全程给药结束后次日,处死动物,称取鼠重、瘤重,肿瘤组织随后用10%的甲醛溶液固定常规脱水、透明、浸蜡并制成石蜡切片,供免疫组化实验用。按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率=(（正常对照组瘤重均值-用药组瘤重均值）/正常对照组瘤重均值×100%抑瘤率＞40%,P＜0.05时为抗肿瘤有意义。实验结果表明,治疗组（100,50,25μg/kg）肿瘤抑制率分别为81.03%,80.85%,50.38%,有明显剂量依赖关系。同时通过病理切片和电镜观察并结合生化指标研究表明,融合蛋白对小鼠的肝脏、肾脏、脾脏和心脏损伤不大,未见到明显的毒性反应,能抑制肿瘤血管的生成。4.通过流式细胞术、ELISA和Western blotting三种方法,我们研究了各细胞表面的EGF受体表达情况。流式细胞术检测细胞EGF受体的表达收集个组细胞于离心管中,离心（1000转5min）后用冰冷的PBS洗细胞2次,将细胞（5×105-1×106）沉淀重悬于50μl的PBS（1.5ml离心管）中,加入适当比例稀释的抗EGFR抗体（10μl/管）,4℃孵育1h,期间间歇摇晃细胞;用含1%血清的PBS洗细胞三次（每次加满离心管）;将细胞沉淀重悬于50μl的PBS中,加入适当比例稀释的FITC标记的二抗（2.5μl）,4℃孵育40min左右;重复步骤3;将细胞沉淀重悬于250μl的PBS中,加入等体积250μl的4%的多聚甲醛,混匀,保存于4℃,待流式检测用（通常可以保存1周左右）。至少检测10000个细胞。ELISA法检测EGFR表达将细胞的培养上清和包被液（0.5mol/L NaHCO3缓冲液,pH 9.6）以1:1的比例混匀,加入酶标板中,每孔100μl,4℃包被24h;倒掉包被液,用含5%小牛血清的PBS封闭过夜;加入EGF抗体,100μl/孔,37℃孵育60min;弃去一抗,用含0.05%TWEEN-20的PBS洗去未结合的抗体,3×5min;加入二抗,每孔100μl,37℃孵育45min,清洗同上;用OPD-H202系统显色,490nm波长测定光吸收值。Western blotting检测EGFR的表达Western blotting分析:在25cm2培养瓶中,用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基将细胞培养至约90%丰度,冷PBS洗细胞3次,加400μl裂解液（60mmTrisPH6.8,2%SDS,10%甘油,0.1M DTT）到细胞表面,冰上晃动5min。将裂解液于100℃煮沸10min,10000rcf离心5min,上清液中的总蛋白浓度以BSA为标准用Lowry法定量。蛋白通过SDS-15%聚丙烯酰胺电泳分离,4℃过夜电转移至硝酸纤维素膜上。用TBSⅠ（100mmol Tris（PH7.4）,0.01%NaN3,5%脱脂奶粉）室温封闭硝酸纤维素膜1h,除去封闭液。用以3%BSA替代脱脂奶粉、且加入兔抗EGFR单抗（1:500）的新制TBSⅠ室温孵育硝酸纤维素膜1h。用100mmolTris（PH7.4）洗膜3×10min,加含羊抗兔IgG-HRP（1:1000）的TBSⅡ（150mmolNaCl,50mmol Tris（PH7.5）,5%脱脂奶粉）室温孵育硝酸纤维素膜1h。用不含脱脂奶粉的TBSⅡ洗膜3×10min,加入酶化学发光底物孵育膜5min,于ChemilmagerTM5500系统上曝光10min获取图像。实验结果表明,A549细胞EGFR含量最高,其次是HepG2细胞,L02细胞含量最低,说明EGF-Linker-TCSKDEL抑制肿瘤细胞生长的作用与EGFR表达高低密切相关的。5.EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白能抑制肿瘤血管的生成,我们选用了血管内皮ECV304细胞和人脐带静脉内皮HUVEC细胞以及经典的鸡胚尿囊膜进行了体外实验。对体外血管内皮细胞生长的影响HUVEC,用2%LSGS的Medium200培养基培养;ECV-304细胞,用10%胎牛血清的RPMI1640培养。取对数生长期细胞,0.25%的胰蛋白酶消化后,HUVEC用相应培养基以5×104/ml接种于96孔板100μl/孔,ECV-304用相应培养基以3×104/ml接种于96孔板100μl/孔。细胞于5%CO237℃培养24h后,添加含不同浓度融合蛋白（0,1,3,10,20,40,80,150,300μg）的同样培养基100μl/孔[对照组（0μg融合蛋白组）12个平行孔,反应每个剂量组设6个平行孔,继续培养48h,按MTT法检测细胞活性。对鸡胚尿囊膜新生血管形成的影响鸡受精卵于37℃孵育3d,用注射器每蛋无菌抽取约2ml蛋清后石蜡封闭针孔,继续孵育4d。将融合蛋白预先以生理盐水稀释成含药0、50、100、200、400、800ng/片的膜（φ约3mm）。于蛋气囊顶端无菌开一约φ1cm的窗口,将反应停药膜放于尿囊膜上,无菌透明胶带封闭窗口,放回孵育箱再孵育48h。用解剖显微镜观察尿囊膜新生血管生成情况并拍摄照片,按文献标准评价新生血管形成。实验结果表明,EGF-Linker-TCSKDEL对体外血管内皮细胞具有明显的生长抑制作用,有明显剂量依赖关系。融合蛋白对HUVEC和ECV-304细胞的平均IC50分别是22.54μg/ml、31.84μg/ml;同时通过解剖显微镜观察及对照文献标准评价,融合蛋白能抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成,抑制作用随剂量增加而增强。6.最后,我们用蛋白印迹实验的方法初步探讨了EGF-Linker-TCSKDEL对导致细胞凋亡的信号通路的影响。如:ERK1/2、AKT通路。尽管我们不能排除EGF-Linker-TCSKDEL诱导肿瘤细胞凋亡的其它机制,但是我们有清晰的证据证明EGF-Linker-TCSKDEL可以下调ERK1/2、AKT信号的磷酸化从而导致肿瘤细胞的凋亡。总结以上研究,我们认为EGF-Linker-TCSKDEL具有明显的抗肿瘤作用,高效低毒,是一个非常值得进一步深入开发研究的靶向抗肿瘤药物。