论文摘要
第一部分血管紧张素Ⅱ及其受体在哮喘大鼠肺组织的表达及其与气道炎症和重塑的关系目的:了解血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其受体在哮喘大鼠肺组织的表达及其与哮喘气道炎症和气道重塑的关系。方法:随机将20只Wistar大鼠分为对照组和哮喘组两组,每组10只。采用OVA腹腔注射致敏、长时间反复OVA雾化吸入复制慢性哮喘动物模型。观察大鼠哮喘发作症状;应用动物肺功能仪测定大鼠气道反应性（以呼气相气道阻力（Re）表示）;支气管肺泡灌洗液（BALF）作细胞总数、分类计数;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量;放射免疫分析法（RIA）检测BALF上清中AngⅡ水平;常规苏木素-伊红（HE）染色观察大体组织病变和炎症细胞浸润;免疫组织化学检测α-SMA染色阳性细胞;应用图像分析软件测量大鼠气道形态学变化。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺组织血管紧张素Ⅱ受体（AGTR）mRNA表达;蛋白质印迹分析（Western blot analysis）AGTR和STAT-3蛋白水平。结果:与对照组相比,哮喘组BALF中细胞总数以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例增加（p＜0.05）,BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量明显增高（p＜0.05～＜0.01）;哮喘组较对照组呼气阻力（Re）明显增高（p＜0.05～0.01）;在小气道水平,哮喘组气道管壁面积/管腔内周长（WAt/Pi）、管壁平滑肌面积/管腔内周长（WAm/Pi）和α-SMA阳性细胞面积/Pi均明显大于对照组（p均＜0.01）。同时,哮喘组BALF中AngⅡ含量高于对照组,哮喘大鼠肺组织AngⅡ受体（AGTR1,AGTR2）mRNA表达和蛋白水平明显增强（p＜0.01）;肺组织STAT3蛋白表达水平在哮喘组明显增高（p＜0.01）。大鼠BALF中细胞总数与AngⅡ含量和肺组织AGTR1mRNA表达水平呈正相关,r=0.523、0.724,p＜0.05～0.01;大鼠小气道Wat/Pi与肺组织AGTR1 mRNA表达水平呈正相关,r=0.671,p＜0.05。结论:大鼠肺组织局部存在血管紧张素系统,AngⅡ及其受体可能参与了哮喘气道炎症和气道重塑。第二部分血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对哮喘大鼠气道炎症及气道重塑的影响目的:观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦对哮喘大鼠气道炎症及气道重塑的影响。方法:随机将50只Wistar大鼠分为对照组、哮喘组、缬沙坦干预组C1、C2、C3组,共5组,缬沙坦干预组（C1、C2、C3组）和哮喘组予OVA致敏和雾化吸入,雾化吸入隔天1次×30天,C1、C2、C3组分别于每次雾化吸入前60 min予缬沙坦15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1灌胃。动物肺功能仪测定大鼠气道反应性;BALF作细胞分类计数;ELISA检测BALF上清中TGF-β1、PDGF、VEGF含量;RIA检测BALF上清中AngⅡ水平;免疫组织化学检测α-SMA染色阳性细胞;图像分析软件测量大鼠气道形态学变化。结果:缬沙坦明显降低哮喘大鼠BALF中细胞总数以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例（p＜0.05～＜0.01）,减少BALF中TGF-β1、PDGF、VEGF含量（p＜0.05～＜0.01）;缬沙坦干预各组气道反应性明显低于哮喘组（p＜0.05～＜0.01）;缬沙坦干预组的C2和C3组WAt/Pi较哮喘组明显减少（p＜0.05）;缬沙坦干预各组（C1、C2、C3组）α-SMA阳性面积/Pi在中、小气道明显低于哮喘组（p＜0.05～0.01）。但BALF上清中AngⅡ水平随缬沙坦剂量增加而升高。结论:血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦可能具有抑制哮喘气道炎症和气道重塑作用。第三部分缬沙坦对哮喘大鼠肺组织血管紧张素Ⅱ及其受体表达的影响目的:观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦对哮喘大鼠肺组织中血管紧张素Ⅱ及其受体表达的影响。方法:随机将50只Wistar大鼠分为对照组、哮喘组、缬沙坦干预组C1、C2、C3组,共5组,缬沙坦干预组（C1、C2、C3组）和哮喘组予OVA致敏和雾化吸入,雾化吸入隔天1次×30天,C1、C2、C3组分别于每次雾化吸入前60 min予缬沙坦15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1灌胃。RIA检测BALF上清和血清中AngⅡ含量;RT-PCR检测肺组织TGF-β1mRNA、VEGF mRNA、AGTR1 mRNA和AGTR2 mRNA表达;Western Blot Analysis检测AGTR和STAT3蛋白水平;原位杂交法检测AGTR1和ATGR2 mRNA在肺组织中分布和表达。结果:缬沙坦干预组的C2组、C3组AngⅡ高于对照组和哮喘组,尤以C3组增高最为明显（p＜0.01）。哮喘组AGTR1 mRNA表达明显高于对照组（p＜0.01）,而缬沙坦干预组（C1、C2、c3组）AGTR1 mRNA表达低于哮喘组（p＜0.01）;对照组和C1组AGTR2 mRNA表达明显低于哮喘组,C2、C3组AGTR2 mRNA表达高于对照组和C1组,但明显低于哮喘组（p＜0.05～0.01）。Western blot分析显示AGTR1蛋白水平结果与AGTR1 mRNA一致（p＜0.01）,但AGTR2蛋白水平在对照组和C1组未检测到,哮喘组AGTR2蛋白水平增高,C2、C3组AGTR2蛋白水平低于哮喘组（p＜0.05）。原位杂交法检测显示AGTR1mRNA表达在哮喘组明显强于对照组和缬沙坦干预组,AGTR2mRNA在哮喘组和缬沙坦干预组C3的表达明显强于对照组和缬沙坦干预组C1、C2。哮喘组TGF-β1 mRNA和VEGF mRNA明显高于对照组（p＜0.01）,缬沙坦干预组（C1、C2、C3组）两者的表达则低于哮喘组（p＜0.01）。哮喘组STAT3蛋白表达明显高于对照组（p＜0.01）,缬沙坦干预组（C1、C2、C3组）STAT3低于哮喘组（p＜0.01）。哮喘大鼠肺组织AGTR1 mRNA表达随缬沙坦剂量增大而减弱,与缬沙坦剂量呈负相关,r=-0.775,p＜0.01。结论:AngⅡ通过AGTR1参与哮喘气道炎症和气道重塑,刺激细胞因子TGF-β1、VEGF、PDGF和信号分子STAT3分泌和表达可能是其部分作用机制。缬沙坦通过阻断AGTR1减轻哮喘的气道病变,其部分机制可能与缬沙坦下调AGTR1表达,降低AngⅡ生物学效应,引起反应性AngⅡ浓度升高有关,高水平的AngⅡ激动了AGTR2,使AGTR2表达上调,产生潜在的气道保护作用。第四部分血管紧张素Ⅱ对人体气道平滑肌细胞增殖的影响及缬沙坦的干预目的:观察AngⅡ对人体气道平滑肌细胞（HASMC）增殖的影响以及缬沙坦的抑制作用。方法:体外原代培养HASMC,传代后给予不同浓度AngⅡ和组织胺（His）刺激,用缬沙坦对AngⅡ和His作用的HASMC进行干预。以四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖能力,流式细胞术（FCM）测定细胞周期和caspase-3表达。结果:（1）MTT法显示,AngⅡ组的吸光度(A570)和生长率明显高于对照组和缬沙坦单药组,以AngⅡ10-5mol/L浓度在第24h为明显（p＜0.01）。AngⅡ+缬沙坦组的A570和生长率明显低于AngⅡ组,缬沙坦的抑制作用在第24h时最为明显（p＜0.01）,且表现一定的浓度依赖关系,以缬沙坦10-3mol/L的抑制作用最为明显。（2）FCM分析,与对照组相比较,AngⅡ10-5mol/L组和His10-2mol/L组的S期百分率明显升高（p＜0.05～0.01）;AngⅡ+缬沙坦组与AngⅡ组相比,S期百分率呈剂量依赖性降低（p＜0.05）,可以看出缬沙坦抑制了AngⅡ诱导的HASMC增殖;His+缬沙坦组与His组相比,显示了和AngⅡ+缬沙坦组与AngⅡ组类似的结果（p＜0.05～0.01）,提示缬沙坦也可以抑制His诱导的HASMC增殖。（3）AngⅡ+缬沙坦组Caspase-3蛋白表达强于AngⅡ组。结论:AngⅡ对HASMC有刺激增殖作用,缬沙坦对AngⅡ诱导的HASMC增殖有抑制作用;缬沙坦可能有促进HASMC凋亡作用,缬沙坦促进HASMC凋亡可能与caspase-3基因表达增加有关。
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