论文摘要
目的梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum subsp.pallidum,TP）引起的一种危害极大的全世界流行的性传播疾病（STD）。采用基因工程抗原建立的酶联免疫吸附实验（ELISA）以其快速、简便、经济等优点在临床梅毒检测中得到广泛应用。但是,目前的检测方法仍然存在灵敏度差、假阳性率高、早期梅毒感染的检出能力较低等缺点。因此,有必要优化现有传统抗原和筛选新抗原,以提高诊断试剂的灵敏度和特异性。本研究旨在通过生物信息学及基因工程技术筛选、制备两种梅毒螺旋体特异性外膜蛋白抗原优势表位区段,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用价值,为进一步研究开发临床检测效果更好的新型梅毒酶联免疫诊断试剂盒提供理论依据和实验数据。方法1.通过文献调研,筛选出具有良好诊断潜力的梅毒螺旋体特异性外膜抗原TP47和TP0453;利用生物信息学方法预测上述抗原蛋白的二级结构及抗原决定簇分布情况,分别选定各个抗原中抗原决定簇丰富、抗原性高、特异性好的区域,并命名为:TP47’、TP0453’。2.根据预测的TP47’、TP0453’抗原优势表位区段基因序列,用分子克隆的方法构建重组表达质粒pET22b（+）-TP47’、pQE30-TP0453’,通过酶切、测序鉴定阳性重组质粒,转化大肠杆菌进行表达,亲和层析纯化,获得纯度较高的目的蛋白。3.将纯化后的TP47’、TP0453’蛋白进行SDS-PAGE后电转移至NC膜,分别以梅毒标准阳性、阴性血清作为一抗,HRP标记的羊抗人IgG为二抗,进行重组蛋白的免疫印迹分析。4.以上述纯化蛋白以及教研室保存的TP17’重组蛋白作为抗原,单独或联合包被酶联免疫反应板,建立双抗原夹心ELISA方法检测梅毒标准阳性和阴性血清。摸索最佳抗原包被浓度组合和最佳酶标抗原稀释度组合、最适抗原吸附方式、最适封闭液和封闭时间、最佳血清反应时间及显色时间等条件。5.用已优化的ELISA检测体系对标准血清（国家质控参比血清、临床科研血清盘血清、定值质控血清）、梅毒阳性血清（各期梅毒病人血清）、梅毒阴性血清（健康体检者、易发生交叉反应人群血清）进行检测,对所建立的ELISA方法进行临床质量评价。结果1.通过生物信息学分析和文献调研,选择TP47、TP0453两个梅毒特异性外膜蛋白作为候选诊断抗原,并预测出各个蛋白抗原决定簇较丰富、抗原性较强、特异性好的区域,分别是:TP47’（68410aa）、TP0453’（62224aa）。2.成功构建了能够高效表达TP47’、TP0453’抗原优势表位区域的重组表达质粒:pET22b（+）-TP47’、pQE30-TP0453’。测序结果显示:与Genbank公布序列相比,TP47’核苷酸和氨基酸的一致性均为99.7%;TP0453’核苷酸和氨基酸的一致性均为100%。3.重组质粒分别转化E.coli BL21（DE3）和E.coli M15获得重组工程菌,经IPTG诱导,表达的目的蛋白TP47’、TP0453’分子量约为39kDa、21kDa。UVP扫描证实目的蛋白的表达分别约占总蛋白的43%和18%。对表达形式进行鉴定:TP47’、TP0453’均以包涵体形式表达。4.用Ni2+亲和层析法分别对TP47’、TP0453’重组蛋白进行纯化,获得的蛋白纯度:TP47’>95%;TP0453’>90%。5.免疫印迹结果显示重组蛋白TP47’、TP0453’与梅毒标准阳性血清有良好的免疫反应性,而与梅毒阴性血清不发生反应。6.联合教研室保存的TP17’重组蛋白建立并优化双抗原夹心ELISA方法,发现检测的灵敏度和特异性受抗原种类和组合比例的影响,其中最适的抗原组合为TP17’和TP47’抗原,而TP0453’抗原在ELISA检测中效果不好;最佳抗原包被浓度及最佳酶标抗原稀释度组合为TP17’（4μg/ml,1:200） +TP47’（2μg/ml,1:50）;抗原最适吸附方式为直接4℃过夜;最适封闭条件为1% BSA 37℃封闭2h转4℃过夜;最适血清反应条件为37℃温育45min;最佳显色时间为室温显色15min。7.经临床质量评价,以TP17’和TP47’为诊断抗原建立的双抗原夹心ELISA方法对标准血清的检测灵敏度为97.2%,特异性为97.1%,符合率97.15%,最低检出限为0.25NCU/ml,批内变异系数（CV）为5.9%,批间变异系数（CV）为9.1%;对临床样本的检测中,本方法和国产ELISA试剂盒相比:灵敏度一致,均为97.7%;特异性本法为98.7%,国产ELISA试剂盒为98.0%,特异性本法略高于国产ELISA试剂盒。结论1.预测出了梅毒螺旋体TP47、TP0453两个特异性抗原优势表位区段:TP47’、TP0453’。2.高效表达了TP47’、TP0453’两种蛋白,并采用亲和层析对其进行了纯化。3.建立并优化了应用TP17’和TP47’蛋白组合作为诊断抗原检测血清中梅毒特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。在初步应用中本方法显示了较高的灵敏度和特异性,本法与国产ELISA试剂盒相比灵敏度一致,特异性略高于试剂盒,为研发新型梅毒诊断试剂盒奠定了理论和实验基础。
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相关论文文献
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