柔嫩艾美耳球虫β-酮脂酰-ACP还原酶基因的克隆表达和酶动力学研究

论文摘要

鸡球虫病是由艾美耳属的一种或几种原虫同时或先后寄生于鸡肠道黏膜细胞所引起的疾病,造成的经济损失巨大。实践证明,抗球虫药物使用在鸡球虫的防治上具有重要作用。但抗药性问题限制了现有抗球虫药物的广泛应用,促使人们不得不寻找新的药物靶标。Ⅱ型脂肪酸合成代谢（TypeⅡfatty acid biosynthesis,FASⅡ）途径是存在于鸡球虫体内的特殊代谢途径,是研究开发新型抗球虫虫药物的潜在靶标。本研究通过生物信息学方法,预测出鸡球虫Ⅱ型脂肪酸合成代谢相关酶之一-β-酮脂酰-ACP还原酶（β-ketoacyl-ACP reductase,KR）的ORF序列,进行克隆和原核表达,分析研究了其酶动力学和抑制动力学特征。实验具体分为以下几个部分:首先通过生物信息学方法对柔嫩艾美耳球虫（E.tenalla）β-酮脂酰-ACP还原酶基因（EtKR）进行预测,获得了EtKR的ORF序列。以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA为模板,用RT-PCR方法成功扩增出长697bp的EtKR基因部分片段;在此基础之上,用RACE技术获得EtKR基因的全长cDNA序列;测序结果表明,EtKR全长cDNA共1799bp,5’和3’非编码区分别为247bp和508 bp,EtKR ORF长为1044bp;根据全长cDNA序列设计特异引物,成功扩增出包含整个ORF的序列片段。EtKR的ORF编码一个由347个氨基酸组成的多肽,信号肽预测和多序列比对结果表明,其N-端包括一个由21个氨基酸组成的信号肽和79个氨基酸组成的转导肽,成熟的EtKR蛋白共由247个氨基酸组成,分子量为24.9 KD。与其它物种KR的氨基酸序列相似性在35-50%之间,具有保守的三联体催化位点（Ser-Tyr-Lys）,属于短链水解还原酶家族。进化树分析表明,EtKR与PfKR处于同一进化枝上。预测的三级结构呈现典型的Rossman折叠,与PfKR的结构最为相似。利用DNA重组技术,选择不同的原核表达载体（pET-32a（+）、pMAL-c2x）,利用E.coli BL21（DE3）重组表达EtKR的成熟基因片段,结果显示两个重组载体都能够得到表达;但pET-32a（+）-EtKR重组表达蛋白以包涵体的形式存在,pMAL-c2x-EtKR表达蛋白大部分存在于上清中。纯化pMAL-c2x-EtKR表达的重组蛋白,制备抗体,利用激光共聚焦技术研究EtKR在E.tenella子孢子内的免疫荧光亚细胞定位。结果显示,EtKR定位于E.tenella子孢子的顶质体,并发现部分子孢子可能具有多个顶质体。以pMAL-c2x-EtKR表达的重组蛋白进行酶动力学、酶抑制动力学分析,结果显示,重组EtKR（rEtKR）不能利用NADPH和AcAcCoA,但是能够与NADH发生反应,其Km值为72.9μM,这种特性是其它物种的KR所不具有的,我们推测rEtKR功能改变的原因可能是在细菌体内重组表达过程中发生了非正确折叠,引起rEtKR空间构象的改变,从而改变rEtKR的功能。酶抑制动力学显示,Hexachlorophene对rEtKR有很强的抑制作用,其IC50为20.9μM。提示EtKR有可能成为开发新抗球虫药的靶标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一章 文献综述
• 1 顶复门原虫Ⅱ型脂肪酸合成代谢研究进展
• 2 顶复门原虫Ⅱ型脂肪酸合成代谢酶与相关抑制物的研究
• 3 β-酮脂酰-ACP还原酶（KR）的研究现状
• 参考文献
• 第二章 柔嫩艾美耳球虫Ⅱ型脂肪酸合成代谢关键酶—β-酮脂酰-ACP还原酶（EtKR）基因的预测、克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 EtKR ORF预测结果
• 2.2 EtKR基因部分片段的克隆及序列分析
• 2.3 5'-RACE扩增产物及重组质粒的PCR鉴定结果
• 2.4 3'-RACE扩增产物及重组质粒的PCR鉴定结果
• 2.5 包含EtKR完整ORF序列的扩增与重组质粒的PCR鉴定结果
• 2.6 EtKR序列分析
• 2.7 EtKR结构分析
• 3 讨论
• 3.1 EtKR ORF序列的预测
• 3.2 EtKR全长序列的扩增
• 3.3 EtKR的引导肽
• 参考文献
• 第三章 EtKR重组表达及其在子孢子内亚细胞定位研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 常用分子生物学试剂和试剂盒
• 1.1.3 亚细胞定位所需材料
• 1.1.4 菌株、载体
• 1.1.5 引物
• 1.1.6 试验动物
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 EtKR成熟基因片段的扩增结果
• 2.2 重组表达质粒的PCR与酶切鉴定
• 2.3 EtKR重组表达质粒在大肠杆菌的诱导表达
• 2.4 pMAL-c2x标签蛋白的诱导表达
• 2.5 EtKR在E.tenella子孢子内的亚细胞定位的研究
• 3 讨论
• 3.1 EtKR的蛋白表达
• 3.2 亚细胞定位的研究
• 参考文献
• 第四章 EtKR的酶动力学及抑制动力学研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 NADH/NADPH标准曲线的建立
• 2.2 rETKR催化底物的确定
• 2.3 rEtKR酶活性的测定
• 2.4 rEtKR对NADH的Km和Vmax值的计算
• 2.5 Hexachlorophene对rEtKR酶活性的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢