庆大霉素高产菌的选育及其发酵条件优化研究

论文摘要

采用实验室保藏的产庆大霉素的棘孢小单胞菌进行发酵试验,首先对所得酵液进行了分析方法方面的研究,主要针对TLC检测体系、HPLC以及离交纯化方法进行了研究。通过较全面的优化分析得到最佳TLC检测体系为:将含羧甲基纤维素钠0.2%,磷酸二氢钠5%,和乙二胺四醋酸二钠0.1%的溶液,与硅胶粉按照3:1的比例混合研磨0.5 h后铺板,采用氯仿:甲醇:氨水（25%）=5:4:3,静置分层,上相饱和,下相展开,碘蒸气显色,检测限为1.0μg。将发酵液简单浓缩后在该体系下检测,可检测到发酵液中的10个左右的组分,为微量组分的研究奠定基础。另外,该体系下检测到的GM C斑点规整,根据直径和颜色可以快速估算出GM C的组分含量情况,与HPLC检测结果进行比较发现两种方法存在较好的一致性;在HPLC检测体系对比分析中,结果表明采用甲醇:水:甲酸=74:21:5配制庚烷磺酸钠溶液（4.0 g/L）为流动相效果更优;采用大孔弱酸DK110型树脂纯化GM,洗脱峰更集中,较732型树脂更便于发酵液的纯化和浓缩操作。为得到优良的庆大霉素（GM）高产菌,以Me07为出发菌,经UV、硫酸二乙酯（DES）和微波诱变处理,以自身代谢终产物为筛子,采取抗性平板以及摇瓶动态选育两种方式,结合TLC及HPLC检测进行优良突变菌株的筛选。筛选得到的产C1组分比例较高的优良突变菌株Me07-1D15,生物效价为1400 U/mL,较出发菌株（680 U/ml）提高了2倍,其发酵液中C1含量最终检测达到47.59%,并且具有良好的遗传稳定性。通过Plackett-Burman实验设计筛选得到影响发酵水平的显著因子为可溶性淀粉、豆饼粉、CoCl2、CaCO3。通过单因素分析及正交分析得到显著因子最佳浓度为:淀粉60 g/L,豆饼粉30 g/L,氯化钴0.008 g/L, CaCO3 4 g/L。对主要发酵条件进行优化研究,得出最佳发酵条件为:种龄选择2 d,接种量为12 mL,发酵培养基初始pH为7.2,最佳装液量为40 mL（500 mL摇瓶）,培养温度34℃,摇瓶转速为250 r/min,培养周期8 d,最佳条件下发酵水平达到1824 U/mL。过程控制研究从降低基质浓度和非营养刺激两方面考察,结果表明适当减少培养基的营养成分可以使产抗期提前;在发酵96h时进行水浴45℃处理可以使GM产量达到1685 U/mL;在144小时添加0.6%的氯化钠溶液,GM产量达到1715 U/mL,是对照试验的1.20倍;在96 h添加4%乙醇,庆大霉素的产量达到1696 U/ml,而当乙醇浓度达到5～6%时,对庆大霉素的合成有副作用,乙醇的添加抑制了棘孢小单孢菌的生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 关于抗生素
• 1.2 关于庆大霉素
• 1.2.1 庆大霉素的结构性质
• 1.2.2 GM 的作用机理
• 1.2.3 GM 优缺点及应用
• 1.2.4 关于GM 产生菌—小单孢菌
• 1.3 国内外对GM 的研究
• 1.3.1 GM 生物合成途径的研究
• 1.3.2 关于GM 产生菌的选育研究
• 1.3.3 GM 发酵液分析方法研究
• 1.3.4 GM 的工业生产情况
• 1.4 课题研究目标和内容
• 1.4.1 立题依据
• 1.4.2 研究目标
• 1.4.3 研究内容
• 第二章 GM 发酵液快速分析方法研究
• 2.1 引言
• 2.2 试验材料与方法
• 2.2.1 材料与试药
• 2.2.2 样品及标准品溶液的制备
• 2.2.3 TLC 检测方法
• 2.2.4 各组分效价检测
• 2.2.5 HPLC 分析
• 2.2.6 发酵液离交分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 薄板制备实验分析
• 2.3.2 展开系统及其分离效果
• 2.3.3 显色剂的比较
• 2.3.4 重现性及最低检测限
• 2.3.5 对发酵液的检测分析
• 2.3.6 快速检测各组分比及效价
• 2.3.7 各组分的效价检测
• 2.3.8 HPLC 两种流动相比较
• 2.3.9 两种树脂离交分析对比
• 2.4 小结
• 第三章 GM 优良高产菌的诱变选育
• 3.1 引言
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 培养基及缓冲液
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌种活化
• 3.3.2 紫外（UV）诱变及筛选
• 3.3.3 硫酸二乙酯（DES）诱变及筛选
• 3.3.4 微波诱变及筛选
• 3.3.5 微生物效价检测
• 3.3.6 TLC 及HPLC 检测
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 孢子抗性测定结果
• 3.4.2 UV 剂量对孢子萌发的抑制
• 3.4.3 UV 诱变后抗生素相对效价的分布
• 3.4.4 UV 突变优良菌株选定
• 3.4.5 UV 突变菌株遗传稳定性考察
• 3.4.6 最小抑制浓度的确定
• 3.4.7 DES 浓度与剂量对致死率的影响
• 3.4.8 微波处理对GM 产生菌致死率的影响
• 3.4.9 最佳诱变处理强度及方式的确定
• 3.4.10 TLC 初筛
• 3.4.11 DES 及微波诱变动态选育
• 3.4.12 DES 诱变抗性平板选育
• 3.4.13 DES 及微波诱变菌株的遗传稳定性考察
• 3.4.14 突变菌株Me07-1D15 发酵产物HPLC 分析
• 3.5 小结
• 第四章 庆大霉素摇瓶发酵条件的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 初始发酵条件
• 4.2.4 Plackett-Burman 实验设计筛选培养基组成
• 4.2.5 正交实验设计考察主要因子交互作用
• 4.2.6 非营养性刺激考察
• 4.3 培养基优化结果与讨论
• 4.3.1 碳源对发酵水平的影响
• 4.3.2 氮源对发酵水平的影响
• 4.3.3 Plackett-Burman 实验
• 4.3.4 显著因子单因素分析
• 4.3.5 正交优化试验
• 4.4 庆大霉素发酵条件的研究
• 4.4.1 种子生长曲线的测定
• 4.4.2 发酵时间对发酵水平的影响
• 4.4.3 种龄对发酵水平的影响
• 4.4.4 装液量对产抗水平的影响
• 4.4.5 发酵起始pH 对产抗水平的影响
• 4.4.6 接种量对产抗水平的影响
• 4.5 降低基质浓度对GM 发酵水平的影响
• 4.5.1 发酵液色素代谢情况
• 4.5.2 发酵液流动性及菌丝生长情况
• 4.5.3 效价的差异
• 4.6 非营养刺激对GM 发酵水平的影响
• 4.6.1 热刺激对发酵水平的影响
• 4.6.2 添加NaCl 对发酵水平的影响
• 4.6.3 添加乙醇对发酵水平的影响
• 4.7 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文