反义磷脂酶D_γ基因转化白三叶草的研究

论文摘要

白三叶草（Trifolium repens）是重要的豆科牧草之一。它既是重要的饲料作物,又在土壤改良、水土保持、以及生态环境保护方面发挥着积极作用。本研究课题以白三叶草为实验材料,以它的芽为外植体进行再生培养,系统地研究了激素浓度、光照条件、外植体密度、培养容器等诸多因素对芽再生芽的影响,建立了白三叶草的芽高频再生体系。在此基础上,用携带反义磷脂酶Dγ基因（PLDγ）的根癌农杆菌介导转化白三叶草芽外植体,通过对转化方法和条件的探索,建立了白三叶草的遗传转化体系。白三叶草遗传转化体系的建立对于利用基因工程对白三叶草进行品种改良起着重要的作用。研究结果表明,不同的激素浓度配比对白三叶草的生长、芽分化、生根等方面有重要影响。通过不同激素浓度配比的实验,确定了最佳壮苗培养基（MS + 0.15mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + 0.1mg/L KT + 20mg/L Ad）叶片再生培养基（MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA）、和生根培养基（1/2 MS + 0.1mg/L NAA）。pH 值、琼脂浓度、温度、湿度等其他物理因素也对白三叶草的生长、分化、生根等有不同程度的影响。分别进行了抑菌性抗生素头孢霉素（Cef）和选择性抗生素卡那霉素（Km）的敏感性试验,结果表明300 mg/L 的Cef 能有效抑制农杆菌过度繁殖。但是白三叶草对Cef 很敏感,Cef 会影响白三叶草的生长、分化,所以选择150mg/L 为最佳抑菌性抗生素浓度。15mg/L Km 可作为诱导叶片芽分化临界筛选浓度。在建立白三叶草芽分化芽高频再生体系的基础上,通过抗生素筛选等步骤,建立并优化了农杆菌介导的白三叶草遗传转化体系。大体过程如下:将培养至对数生长期的农杆菌（OD600=0.5） 用等体积的5%的蔗糖溶液（含一定浓度的表面活性剂）稀释成浸染液,浸染白三叶草芽8 分钟,将浸染之后的芽外植体置于含上述蔗糖溶液的带有两层滤纸的培养皿中,暗培养1 天后再于光下共培养3 天。经无菌蒸馏水冲洗叶片3 次,滤纸吸干表面

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物耐盐碱、抗干旱基因工程研究进展
• 1.1.1 耐盐、抗旱调渗物质合成基因的克隆及作用机理
• 1.1.1.1 Imtl 基因
• 1.1.1.2 mtl D 基因和gut D 基因
• 1.1.1.3 ots 基因和TPS 基因
• 1.1.1.4 P5cs 基因
• 1.1.1.5 bets 基因和BADH 基因
• 1.1.2 植物抗盐和耐旱信号传导和表达调控的研究进展
• 1.1.2.1 信号传递和调控基因表达的转录因子
• 1.1.2.2 感应和传导胁迫信号的蛋白激酶
• 1.2 磷脂酶D（PLD）基因的作用及研究进展
• 1.2.1 磷脂酶D 的发现和PLD 基因家族
• 1.2.2 PLD 的生理作用
• 1.3 基因工程在白三叶草育种中的应用
• 1.4 选题依据
• 1.4.1 PLD 基因在植物育种上的应用潜力
• 1.4.2 白三叶草耐盐性研究的重要性
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 细菌培养基
• 2.1.4 植物激素和植物培养基
• 2.1.4.1 植物激素
• 2.1.4.2 植物培养基
• 2.1.5 试剂
• 2.1.5.1 抗生素
• 2.1.5.2 植物基因组DNA 提取液
• 2.1.5.3 大肠杆菌质粒提取缓冲液
• 2.1.5.4 农杆菌双元载体质粒提取试剂
• 2.1.5.5 电泳缓冲液配制
• 2.1.5.6 Southern 杂交试剂
• 2.1.5.7 酶与生化试剂
• 2.1.6 PCR 引物
• 2.1.7 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 白三叶草再生体系的建立
• 2.2.1.1 无菌苗的获得
• 2.2.1.2 壮苗培养
• 2.2.1.3 芽分化培养
• 2.2.1.4 根的诱导
• 2.2.2 白三叶草遗传转化体系的建立
• 2.2.2.1 选择培养基中选择压的确定
• 2.2.2.2 Cef 浓度对芽分化的影响
• 2.2.2.3 农杆菌介导转化
• 2.2.2.4 转化条件的优化
• 2.2.3 转化植株的分子检测
• 2.2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.3.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化
• 2.2.3.3 碱法少量提取质粒DNA
• 2.2.3.4 提取农杆菌双元载体质粒
• 2.2.3.5 植物基因组DNA 的提取
• 2.2.3.6 PCR 检测及电泳分析
• 2.2.3.6.1 PCR 反应体系
• 2.2.3.6.2 PCR 反应程序
• 2.2.3.6.3 电泳
• 2.2.3.7 PCR-Southern 检测
• 2.2.4 转化植株的耐盐性鉴定
• 2.2.5 转化植株的抗旱性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 白三叶草再生体系的建立
• 3.1.1 白三叶草无菌苗的获得
• 3.1.2 壮苗培养基的筛选
• 3.1.2.1 激素的影响
• 3.1.2.2 其他理化因素的影响
• 3.1.3 组培苗的芽再生
• 3.1.3.1 再生芽的获得
• 3.1.3.2 不同激素浓度对芽分化的影响
• 3.1.3.3 光照对芽分化的影响
• 3.1.3.4 琼脂浓度对芽分化的影响
• 3.1.3.5 培养容器对芽分化的影响
• 3.1.3.6 外植体密度对芽分化的影响
• 3.1.4 白三叶草根的诱导
• 3.1.4.1 生根培养基的筛选
• 3.1.4.2 琼脂浓度对生根的影响
• 3.2 白三叶草遗传转化体系的建立
• 3.2.1 选择压的确定
• 3.2.2 抑菌性抗生素的选择
• 3.2.3 预培养对转化的影响
• 3.2.4 农杆菌菌液浓度对转化的影响
• 3.2.5 侵染时间对转化的影响
• 3.2.6 共培养对转化的影响
• 3.2.7 恢复培养对转化的影响
• 3.2.8 转化植株的获得
• 3.3 转基因植株的生物学鉴定
• 3.3.1 PCR 扩增检测
• 3.3.2 PCR-Southern 杂交检测
• 3.3.3 转反义PLDγ基因植株的耐盐性测定与筛选
• 3.3.4 耐盐性植株的抗旱性测定
• 4 讨论
• 4.1 白三叶草的遗传转化体系的建立
• 4.2 农杆菌介导转化方法的优化
• 4.3 生物基因表达的反义调控
• 4.4 预期结果的实现需要大田试验
• 4.5 下一步工作设想
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间形成的学术论文