抗羟基红花黄色素A多克隆抗体的制备

论文摘要

羟基红花黄色素A（HydroxySafflor yellow A, HSYA,简称羟A）是红花的主要药理物质,羟A含量高低是评价红花药材质量及相应中药制剂质量的主要指标。探索快速简便准确的测定象羟A这类小分子中药有效成分的检测方法对于判断药材的优劣和在药效成分的制备中进行质量控制以及分析药物代谢动力学等方面都具有广泛的价值。本文研究了羟A人工抗原的合成途径,进而利用抗原抗体特异性结合原理,最终获得特异性抗羟A抗血清,为深入研究建立羟基红花黄色素A的ELISA检测方法及其在体内代谢的免疫学分析研究奠定了基础。首先研究了羟A的反应溶剂条件,前后分别以水、50%乙醇和80%的甲醇为溶剂判定溶解羟A的特点。通过六个月4℃下保存上述三种羟A的反应溶剂,观察紫外吸收峰形特征变化。结果发现选用80%甲醇为溶剂羟A的紫外吸收峰特征峰明显、稳定性高且不出现沉淀物,以水和50%乙醇为溶剂则峰形变宽、特征不明显并且出现沉淀物。说明选用80%甲醇为后续的反应溶剂是比较理想的。与此同时研究了羟A和载体蛋白的偶联方法,先后选用的方法有过碘酸钠法、戊二醛法和直接法。采用过碘酸钠法合成了HSYA-BSA和HSYA-OVA两种人工抗原。先后设计了HSYA:BSA=1:2.5,1:5,1:7.5,1:10的量进行反应,结果发现1:2.5和1:7.5的反应体系在SDS-PAGE电泳中均可以观察到一条大于67KD的条带;紫外扫描发现偶联前后紫外峰型发生了变化,说明经过过碘酸钠法处理载体蛋白和羟A发生了结合。同时依据BCA法、Bradford法进行透析后蛋白浓度定量。通过制作紫外扫描图谱和依据标准曲线方程得到了相应的偶联比率为77.5:1和56:1。但是对昆明白老鼠的五次免疫均没有检测到针对抗羟A的抗体。随后采用戊二醛法和直接法合成HSYA-BSA和HSYA-OVA两种人工抗原。戊二醛法合成的人工抗原紫外峰型杂乱,故弃之。直接法合成的人工抗原不仅在紫外扫描中表现HSYA和BSA（OVA）的特征吸收峰;而且在红外扫描中明显具有HSYA特征官能团的吸收峰和氨基酸的特征吸收峰;用昆明白鼠免疫,经间接ELISA检测,二免就检测到抗HSYA的特异性抗体,五免血清效价可达1:3200。最后选用直接法分别合成免疫抗原HSYA-BSA和包被抗原HSYA-OVA,用合成的人工抗原免疫新西兰大白兔。ELISA检测理想的包被抗原的浓度为4ug/ml,抗血清和二抗的工作浓度分别为1:200和1:2000;用间接竞争ELISA法检测对羟A抗体抑制率为50%时, HSYA的浓度是1.5ug/ml ,检测限范围5.75ng/ml-6309ng/ml之间,实际有效抑制范围为42.5%-74%。交叉反应试验表明,该抗体与芦丁、金合欢素的反应率均接近于零。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1. 红花的化学成分、药理作用及研究意义
• 2. 目前中药有效成分检测的主要方法
• 3. 免疫分析方法的建立
• 4. 单抗和多抗在药物残留检测中的比较
• 5. 本研究的目的及意义
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第一章 羟基红花黄色素A 人工抗原的制备
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 小结
• 参考文献
• 第二章 羟基红花黄色素A 人工抗原两种制备方法的比较
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 小结
• 参考文献
• 第三章 抗羟基红花黄色素A 多克隆抗体的制备
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 小结
• 参考文献
• 总结
• 致谢
• 个人简历