论文摘要
前言皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC,简称鳞癌）是常见的皮肤恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升趋势,临床危害严重。目前,外科手术仍然是治疗皮肤鳞癌的首选方法,然而对于多发性皮肤鳞癌的治疗及预防复发仍然是目前尚需解决的难题。因此,寻求有效的药物进行系统治疗具有重要意义。维甲酸类（retinoids）包括维生素A的天然及人工合成的衍生物,具有广泛的生物活性。维甲酸对正常上皮的分化具有重要的调节作用,临床上已被用来治疗和预防许多皮肤病及皮肤肿瘤。临床中发现口服第一代维甲酸可以治疗皮肤鳞癌或减少高危人群发生皮肤鳞癌的危险性。二代维甲酸阿维A酸能有效地抑制肾移植患者以及银屑病患者因应用光化学疗法后并发的皮肤鳞癌的生长,还能治疗原发性多发的皮肤疣状癌。第三代维甲酸他扎罗汀在体外可有效抑制皮肤基底细胞癌细胞的增殖并诱导其凋亡。此外,为了提高肿瘤对维甲酸治疗的敏感性,维甲酸与干扰素的联合应用在皮肤鳞癌、肺癌、肝癌等的临床试验治疗中也取得了一定的进展。维甲酸类是唯一的一种有效预防皮肤肿瘤的药物,其抗皮肤鳞癌的机制尚未完全阐明。本研究以人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株为靶细胞,观察三代不同的维甲酸及维甲酸与干扰素α-2a（IFNα-2a）联合应用对SCL-1细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,探讨维甲酸诱导皮肤鳞癌细胞凋亡的分子转导机制,为临床应用维甲酸治疗皮肤鳞状细胞癌提供有价值的依据。方法1、细胞培养SCL-1细胞、HaCaT细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液中,置于5%CO2、37℃孵箱中传代培养。2、MTT比色法测定细胞增殖活性（1）阿维A酸对SCL-1细胞增殖的影响;（2）全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）、他扎罗汀对SCL-1细胞增殖的影响;（3）阿维A酸对HaCaT细胞增殖的影响;（4）联合应用阿维A酸和IFNα-2a对SCL-1细胞增殖的影响;3、Cell Death Detection ELISA检测细胞凋亡（1）阿维A酸对SCL-1细胞的凋亡诱导作用;（2）ATRA、他扎罗汀对SCL-1细胞的凋亡诱导作用;（3）阿维A酸对HaCaT细胞的凋亡诱导作用;（4）联合应用阿维A酸和IFNα-2a对SCL-1细胞的凋亡诱导作用;4、Annxin-V和PI结合实验检测早期凋亡（1）Annxin-V和PI结合实验检测ATRA、阿维A酸及他扎罗汀诱导的早期凋亡率;（2）Annxin-V和PI结合实验检测联合应用阿维A酸和IFNα-2a诱导的早期凋亡率;5、流式细胞仪检测细胞周期6、凋亡的形态学改变（1）透射电镜观察阿维A酸对SCL-1细胞形态的影响;（2）丫啶橙荧光染色观察联合应用阿维A酸和IFNα-2a对SCL-1细胞形态的影响;7、Western blot分析（1）Western blot检测阿维A酸诱导前后SCL-1细胞死亡受体途径中蛋白（Fas、FasL、FADD、caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP）的表达情况;（2）Western blot检测阿维A酸和IFNα-2a诱导前后SCL-1细胞caspases蛋白的表达情况;8、流式细胞仪检测阿维A酸诱导前后SCL-1细胞膜表面分子Fas表达9、实时荧光定量RT-PCR检测Fas,FasL mRNA表达10、ELISA阻断实验（1）Caspase-8、caspase-9抑制剂对阿维A酸诱导SCL-1细胞凋亡的影响;（2）Fas中和抗体ZB4对阿维A酸诱导SCL-1细胞凋亡的影响;结果1、MTT比色分析法检测处理因素对细胞增殖的影响阿维A酸可显著抑制SCL-1细胞的生长,具有浓度及时间依赖性（P均＜0.01）。3种维甲酸均能抑制SCL-1细胞的生长,并具有时间依赖性;其中阿维A酸作用最为显著（P均＜0.05）。阿维A酸对HaCaT细胞也有抑制作用,但在相同的作用时间下,明显弱于阿维A酸对SCL-1细胞的增殖抑制作用,差异具有统计学意义。阿维A酸和IFNα-2a联合应用可抑制SCL-1细胞增殖,与阿维A酸或IFNα单独应用比较,差异有显著性（P＜0.05）。2、Cell Death Detection ELISA检测细胞凋亡阿维A酸能诱导SCL-1细胞凋亡,具有明显的量效和时效依赖性关系（P均＜0.01）。浓度为1×10-5mol/L的3种维甲酸均能不同程度地诱导SCL-1细胞凋亡,具有时间依赖性,;其中阿维A酸作用最强（P均＜0.05）。同样浓度和同样作用时间的阿维A酸对HaCaT细胞的凋亡诱导强度明显弱于SCL-1细胞。阿维A酸和IFNα-2a联合应用可显著诱导SCL-1细胞凋亡,与阿维A酸或IFNα单独应用比较,有显著性差异（P均＜0.05）。3、流式细胞仪检测结果Annxin-V和PI结合实验显示全反式维甲酸、阿维A酸及他扎罗汀均能显著诱导SCL-1细胞凋亡,将细胞阻滞于G1期,其中阿维A酸的作用最强。阿维A酸和IFNα-2a联合应用可诱导SCL-1细胞早期凋亡,具有协同作用。4、形态学改变透射电镜观察显示:阿维A酸作用SCL-1细胞5d后,肿瘤细胞胞膜上绒毛消失,细胞核内染色质浓缩、聚集。对照组SCL-1细胞胞膜富含绒毛、核仁清晰、核内染色质分布均匀。荧光显微镜可见,阿维A酸和IFNα-2a联合作用SCL-1细胞3d后,肿瘤细胞核形态明显不规则,胞核染色质呈黄绿色浓聚于核膜内侧,核固缩、碎裂,可见凋亡小体。阿维A酸、IFNα-2a单独给药组,未见SCL-1细胞明显凋亡表现。对照组细胞胞浆呈红色,细胞核染色质呈淡黄绿色、分布均匀、核形态规则。5、Western blot结果阿维A酸作用SCL-1细胞12h后,能明显上调其Fas、FasL、Fas相关死亡结构域（Fas-associated death domain,FADD）的蛋白表达及活化caspase-8,具有时间依赖性。作用SCL-1细胞24h后开始明显活化caspase-9,caspase-3和caspase-3的底物多聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（Poly ADP-Ribose Polymerase,PARP）,活化程度随着作用时间的延长而增强。阿维A酸与IFNα-2a合用组能明显活化caspase-8,-3蛋白,两药合用组与对照组、ATRA、IFNα-2a组比较,有显著性差异（P＜0.05）。6、阿维A酸对细胞膜表面Fas抗原表达的影响阿维A酸作用SCL-1细胞48h后,能明显上调细胞膜表面Fas抗原的表达,与对照组比较,差异有显著性（P＜0.05）。7、Fas,FasL mRNA表达变化RT-PCR结果显示,阿维A酸作用SCL-1细胞12h后,能明显上调Fas、FasLmRNA水平,并随着作用时间的延长而增强。8、阻断实验结果Caspase-8抑制剂能有效阻断阿维A酸诱导的SCL-1细胞凋亡,而caspase-9抑制剂对阿维A酸诱导的凋亡无明显影响。Fas中和抗体ZB4显著阻断阿维A酸诱导的凋亡,与阿维A酸组比较,差异有统计学意义。结论1、全反式维甲酸、阿维A酸及他扎罗汀可抑制体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株增殖并诱导其凋亡,其中阿维A酸作用最为显著。2、阿维A酸是通过死亡受体Fas信号转导途径来诱导SCL-1细胞凋亡的,在SCL-1细胞中诱发了FasⅠ型凋亡反应。3、阿维A酸/IFNα联合应用可抑制SCL-1细胞的增殖并诱导其凋亡,机制与活化凋亡相关蛋白caspase-8和caspase-3有关。
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