高温热激下雌雄B型烟粉虱差异表达基因的筛选和Hsps基因功能的鉴定

论文摘要

温度是决定物种分布和扩散的重要因素。B型烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一种入侵性强的农业害虫,对高温逆境有很强的适应能力。本论文以B型烟粉虱为研究对象,在研究组前期工作积累的基础上,重点采用抑制消减杂交（SSH:suppression subtractive hybridization）、RNA干涉（RNAi:RNA interference）等分子生物学技术手段,对雌雄烟粉虱耐热性差异进行了深入研究。主要结果和结论如下:1.雌性烟粉虱比雄性耐热:高温（≧44℃）热激1h,雄虫的死亡率显著高于雌虫。2.筛选了雌性和雄性烟粉虱在高温热激下的差异表达基因:1)构建了44℃热激1h条件下的雌性SSH文库,并通过斑点杂交筛选获得50个差异表达的ESTs（Expression Sequence Tags）。其中有26（52%）条能与NCBI上的序列显著性匹配（E-value < 10-5）,包括16个已知功能的ESTs,10个已报道但未知功能的ESTs,其余的24条为没有显著性匹配的序列（E-value > 10-5）,为新发现的ESTs。这些差异表达的ESTs按其功能分类可分为四类:热胁迫相关的ESTs、新陈代谢相关的ESTs、已报道但功能未知的ESTs、以及未报道的新ESTs。2)构建了44℃热激1h条件下的雄性SSH文库,并通过斑点杂交筛选获得83个差异表达的ESTs。其中有42（50.6%）条能与NCBI上的序列显著性匹配（E-value < 10-5）,包括31个已知功能的ESTs,11个已报道但未知功能的ESTs,而其余的41条没有显著性匹配的序列（E-value > 10-5）,为新发现的ESTs。这些差异表达的ESTs按其功能分类可分为四类:热胁迫相关的ESTs、新陈代谢相关的ESTs、已报道但功能未知的ESTs、以及未有报道的新ESTs。此外,利用实时定量PCR对3个差异表达基因进行验证,从而确保所获得的差异表达基因的可靠性。3)这四类基因分别以不同的频率在雌雄库中出现:其中热胁迫相关的ESTs（雌性:30%;雄性:33.7%）、新陈代谢相关的ESTs（雌性:2.0%;雄性:3.6%）和新ESTs（雌性:48.0%;雄性:49.4%）在雌性中出现的频率比在雄性中出现的频率低,而已报道但功能未知的ESTs（雌性:20.0%;雄性:13.3%）在雌性中出现的频率较雄性的高。3.分析了不同温度热激下雌性和雄性烟粉虱hsp23, hsp70和hsp90 mRNA的表达动态:1)不同高温热激下,雌性和雄性烟粉虱Hsps（Heat shock proteins）基因（hsp23, hsp70和hsp90）mRNA表达动态基本相似:Hsps mRNA的表达量随着温度的升高而增加,当到达一定高温时,靶基因mRNA的表达量达到高峰;之后随着温度的升高,其表达量降低。雄性hsp70 mRNA的表达量在44℃到达高峰,而雌性hsp70 mRNA的表达量在42℃达到高峰;雌性和雄性hsp23和hsp90 mRNA表达量均在40℃达到高峰。2)不同高温热激下,雌性hsp23和hsp70 mRNA表达量高于雄性,但44℃条件下,雄性hsp70mRNA的表达量高于雌性;雌性和雄性hsp90 mRNA表达水平无显著差别。4. RNAi实验证明,hsp23和hsp70在雌性烟粉虱耐热中起关键作用,但在雄性中作用不明显;hsp90在雌性和雄性烟粉虱耐热中的作用均不明显:1)饲喂dsRNA 3h显著降低了雌性和雄性Hsps基因（hsp23, hsp70和hsp90）mRNA的表达水平。2)饲喂hsp23或hsp70 dsRNA 3h,然后置于44℃热激1h。与对照相比,雌性存活率显著降低,而雄性存活率无显著变化。3)饲喂hsp90 dsRNA 3h,然后置于44℃热激1h。与对照相比,雌雄的存活率均无显著变化。综上所述,雌性B型烟粉虱耐热是由多基因差异表达调控的。热激条件下,雌性烟粉虱通过调节体内的热激基因使之处于适量表达水平,从而保证了较高的存活率。hsp23和hsp70在此过程中起关键作用。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 全球变暖对昆虫分布的影响

1.2 昆虫适应高温的机理研究

1.2.1 昆虫适应高温的生理生化机理

1.2.2 昆虫适应高温的分子机理

1.3 B型烟粉虱的耐热性研究

1.3.1 B型烟粉虱是一种世界性的重要害虫

1.3.2 气候适应是B型烟粉虱入侵并成功扩张的重要因素

1.3.3 B型烟粉虱耐热性的研究进展

1.4 抑制性消减杂交在昆虫研究中的应用

1.4.1 SSH的原理及主要实验流程

1.4.2 SSH技术的改进

1.4.3 SSH技术和其它差异表达分析技术的比较

1.4.4 SSH技术在昆虫研究领域中的应用

1.5 RNA干扰技术在昆虫研究中的应用

1.5.1 RNAi的原理

1.5.2 RNAi技术

1.5.3 RNAi在昆虫研究中的应用

1.6 本研究的总体思路、主要内容和技术路线

1.6.1 总体思路和主要内容

1.6.2 技术路线

第二章高温热激对烟粉虱雌雄成虫存活率的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 供试昆虫和寄主植物

2.1.2 实验方法

2.1.3 数据分析

2.2 结果与分析

2.3 小结与讨论

第三章高温下雌雄烟粉虱差异表达基因的筛选

3.1 材料与方法

3.1.1 材料准备与仪器试剂

3.1.2 RNA提取

3.1.3 雌虫SSH文库的构建

3.1.4 雄虫SSH文库的构建

3.1.5 斑点杂交

3.1.6 测序及序列分析

3.1.7 Q-PCR验证

3.1.8 数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 RNA的提取

3.2.2 cDNA的合成

3.2.3 cDNA的酶切

3.2.4 差减杂交效率

3.2.5 差减产物克隆及文库质量的评价

3.2.6 斑点杂交筛选阳性克隆

3.2.7 差异表达克隆测序及序列分析

3.2.8 雌雄烟粉虱的差异表达ESTs的功能分析

3.2.9 Q-PCR的标准曲线

3.2.10 Q-PCR检测

3.3 小结与讨论

第四章高温对雌雄烟粉虱hsp23, hsp70 和hsp90 mRNA表达的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 材料准备与仪器试剂

4.1.2 RNA提取及cDNA合成

4.1.3 引物、探针设计及合成

4.1.4 标准样品的制备及标准曲线的建立

4.1.5 hsp23, hsp70 和hsp90 mRNA表达的定量检测

4.1.6 数据分析

4.2 结果与分析

4.2.1 标准曲线

4.2.2 高温对雌雄烟粉虱hsp23 mRNA表达的影响

4.2.3 高温对雌雄烟粉虱hsp70 mRNA表达的影响

4.2.4 高温对雌雄烟粉虱hsp90 mRNA表达的影响

4.3 小结与讨论

第五章 hsp23, hsp70 和hsp90 在雌性烟粉虱耐热中的作用

5.1 材料与方法

5.1.1 实验昆虫和仪器试剂

5.1.2 dsRNA模板的制备

5.1.3 dsRNA的合成和纯化

5.1.4 dsRNA饲喂

5.1.5 RNAi转录分析

5.1.6 存活率观察

5.1.7 数据分析

5.2 结果与分析

5.2.1 含T7 引物的PCR扩增

5.2.2 dsRNA的合成

5.2.3 相对定量PCR的溶解曲线

5.2.4 相对定量PCR的标准曲线

5.2.5 dsRNA处理对烟粉虱hsp23 mRNA表达的影响

5.2.6 dsRNA处理对雌雄烟粉虱hsp23 mRNA表达的影响

5.2.7 hsp23 基因的dsRNA处理对雌雄烟粉虱耐热性的影响

5.2.8 dsRNA处理对雌雄烟粉虱hsp70 mRNA表达的影响

5.2.9 hsp70 基因的dsRNA处理对雌雄烟粉虱耐热性的影响

5.2.10 dsRNA处理对雌雄烟粉虱hsp90 mRNA表达的影响

5.2.11 hsp90 基因的dsRNA处理对雌雄烟粉虱耐热性的影响

5.3 小结与讨论

第六章结论与展望

6.1 结论

6.2 本研究的创新点

6.3 展望

参考文献

致谢

个人简历

高温热激下雌雄B型烟粉虱差异表达基因的筛选和Hsps基因功能的鉴定

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢