运用原子力显微术对急性分离平滑肌细胞进行高分辨成像及微观力学研究

论文摘要

原子力显微镜(AFM)是扫描探针家族中的一员,它通过控制并检测扫描微悬臂上的针尖——样品间的相互作用力,不仅可以实现样品表面形貌的纳米尺度上的高分辨成像,而且可以进行分子间相互作用力的检测。由于AFM独特的成像方式,使其己广泛应用于生物样本的研究中。近些年来AFM作为一种高分辨的成像手段用于生物样品超微结构研究的同时,越来越多的被用于微观力学性质的探测中。血管平滑肌细胞在血管张力的调节中起着关键作用,而微血管平滑肌细胞的功能则直接影响微循环状态。因此,在接近生理状态下对急性分离的微动脉平滑肌细胞进行微观力学研究,将非常有助于多种心血管疾病,如动脉粥样硬化、失血性休克发病机制的深入研究。但迄今为止这方面的报导很少。前期工作查明,培养的3T3细胞经戌二醛固定后,AFM观察细胞表面出现大量凹陷结构,与未固定的活体细胞有明显差异。本项研究的目的是观察急性分离的平滑肌细胞(它不具有培养细胞的贴壁能力,又不希望用戌二醛固定),能在接近生理条件下,用AFM高分辨成像,并观察收缩前后微观力学性质的改变。因此本项工作包括三个部分①寻找一个固定急性分离活体细胞的方法,以用于AFM采样;②减少AFM成像过程对细胞的损伤,取得真实的活体高分辨图像;③探索合适的用AFM分析细胞力学性质的方法。一,微米水平微阵列机械固定法实验采用离子刻蚀技术在硅片上刻制硬模板,用软蚀刻技术制备弹性模板,运用复制模塑法制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)微柱结构,其中柱体的边长尺寸为4μm,柱体间距为8μm,深度为3μm。用多聚左旋赖氨酸涂铺PDMS微阵列模板表面。采用木瓜酶和胶原酶两步酶消化法快速分离正常大鼠的肠系膜动脉平滑肌细胞,将细胞悬液离心固定于预处理过的PDMS模板上。环境扫描电镜下观察显示,细胞被较好地限制在PDMS微结构之间。由于微柱组成阵列结构,并不影响细胞的自主伸缩,非常适合于在接近生理的环境中,应用AFM对活细胞进行高分辨成像及微观力学的研究。二,原子力显微术平滑肌活体细胞成像的研究运用最新发展的磁驱动轻敲模式(MAC mode AFM),使用弹性系数小的微悬臂,以及小的驱动振幅,对机械固定于微柱阵列中的急性分离平滑肌细胞进行成像。结果显示,活细胞成像分辨率Z轴可达30 nm,可接近环境扫描电镜分辨程度。刺激(去甲肾上腺素或者机械刺激)引起平滑肌细胞收缩,提示此方法可应用于其它杆状未贴壁细胞的AFM高分辨成像,对细胞的损伤很小,细胞仍具有收缩的机能。三,原子力显微术平滑肌细胞微观力学性质的研究实验采用微阵列结构固定急性分离的正常大鼠的肠系膜动脉平滑肌细胞,运用原子力显微术接触模式扫描样品的同时采集每一点的力——微悬臂偏转曲线。运用AFM的force volume imaging手段研究细胞局部硬度,以及平滑肌细胞经去甲肾上腺素刺激后微观力学性质变化,采集细胞不同区域力曲线观察细胞力学性质变化。将力曲线逼近部分偏转/位移曲线处理成直方图,研究细胞力学性质药物刺激后的变化。结果显示细胞不同区域硬度有明显差别,即中央区域较周边软,去甲肾上腺素(0.02mg/ml)刺激前后细胞硬度整体增加,但周围增加明显。提示平滑肌细胞的弹性作功主要来源于周边应力区。总之,本项研究建立了一个用原子力显微镜在纳米水平既观察平滑肌细胞形态学变化,又观察收缩机能的方法。它包括微阵列单细胞机械固定,适用活细胞的磁驱动轻敲模式AFM成像,及运用Force volume imaging对细胞进行微观力学研究。希望通过本课题的研究,可将生物医学亟待解决的问题与最新发展的物理新成像手段有机结合,探索心血管系统研究的新方法及新途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第1章 用于原子力显微术的急性分离平滑肌细胞机械固定
• 1.1 软刻蚀技术
• 1.1.1 软刻蚀技术概述
• 1.1.2 软刻蚀技术的优点
• 1.1.3 软刻蚀技术的关键
• 1.1.4 PDMS的特点
• 1.1.5 软刻蚀技术方法
• 1.1.5.1 复制模塑（Replica molding,REM）
• 1.1.5.2 转移微模塑（Microtransfer Molding,μTM）
• 1.1.5.3 毛细微模塑（micromolding in capillaries,MIMIC）
• 1.1.5.4 溶剂辅助微模塑（Solvent-assistedmicromolding,SAMIM）
• 1.2 原子力显微术细胞固定方法
• 1.2.1 自然干燥固定法
• 1.2.2 细胞自然伸展贴壁
• 1.2.3 吸附蛋白增强固定
• 1.2.4 用交联剂固定
• 1.2.5 静电相互作用固定细胞
• 1.2.6 琼脂糖凝胶固定细胞
• 1.2.7 多孔聚合物膜固定细胞
• 1.2.8 微井固定细胞
• 1.3 原子力显微术急性分离平滑肌细胞机械固定
• 1.3.1 实验方法
• 1.3.1.1 弹性模板的制备
• 1.3.1.2 复制模塑法制备PDMS微结构
• 1.3.1.3 两步酶消化法分离细动脉平滑肌细胞
• 1.3.1.4 平滑肌细胞的固定
• 1.3.1.5 环境扫描电镜样品的制备
• 1.3.2 实验结果
• 1.3.3 讨论
• 第2章 原子力显微术平滑肌细胞超微结构研究
• 2.1 原子力显微术介绍
• 2.1.1 AFM工作原理
• 2.1.2 原子力显微镜系统硬件结构
• 2.1.2.1 力检测部分
• 2.1.2.2 位置检测部分
• 2.1.2.3 反馈系统
• 2.1.3 AFM成像特点
• 2.1.4 AFM工作模式
• 2.1.4.1 接触模式
• 2.1.4.2 非接触模式
• 2.1.4.3 轻敲模式
• 2.1.4.4 MAC mode
• 2.2 原子力显微术急性分离平滑肌细胞成像
• 2.2.1 实验方法
• 2.2.1.1 原子力显微镜样品准备
• 2.2.1.2 运用MAC mode AFM进行细胞成像研究
• 2.2.2 实验结果
• 2.2.3 讨论
• 第3章 原子力显微术平滑肌细胞力学性质研究
• 3.1 原子力显微术力的探测
• 3.1.1 Force volume imaging
• 3.1.2 力曲线
• 3.1.3 力曲线分析细胞杨氏模量
• 3.1.4 力曲线分析样品弹性信息其他方法
• 3.2 平滑肌细胞力学性质探测
• 3.2.1 实验方法
• 3.2.1.1 急性分离平滑肌细胞固定
• 3.2.1.2 用force volume imaging试探细胞的力学性质
• 3.2.2 实验结果
• 3.2.3 讨论:
• 全文小结
• 参考文献
• 附:原子力显微镜磁驱动轻敲模式在活细胞成像中的应用的研究
• 学习期间的工作
• 致谢
• 统计学证明