甘草多糖的提取及对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节

论文摘要

几千年来,甘草因具有广泛的医用药用价值,被历代名医尊称为“众药之王”。甘草多糖（glycyrrhiza polysaccharid,GP）是甘草中重要活性成分之一,近些年来的药理学研究表明,GP具有增强免疫、噬菌、抗病毒、抗补体等作用,且没有细胞毒副作用,但目前对GP的研究相对较少,并且多以粗多糖为试验材料。本论文以提取纯化GP为原料,详细研究了GP对巨噬细胞的免疫调节机理。首先,对影响GP提取率的主要因素进行了研究,先采用单因素试验确定出合适的水平,然后利用响应面程序进行优化,最佳提取条件为液固比10.27∶1,浸提温度88.53℃,浸提时间140.97 min,提取次数为2次,理论上粗多糖提取率可达4.25%,其中浸提时间对提取率的影响最大。通过对多糖析出条件的研究,证明浓缩后体积为提取液总体积的1/4-1/5,浓缩液与无水乙醇的体积比在1∶3-1∶4,在4℃条件多糖提取率较高,GP经过DEAE-52和G-200层析柱的洗脱分离,冷冻干燥后为纯度约为90.7%,多糖得率约为0.87%。通过高效液相色谱法确定GP的相对分子量约为11 kDa。利用原子力显微镜观察,GP是具有空间结构的复杂大分子,是以葡萄糖为主链,通过α-（1,4）键连接的单一吡喃型葡聚糖结构。同时发现GP分子链呈现出单个的分子链及其多个侧枝的结构,并且还有些大大小小的环状和螺旋状结构,GP分子间存在螺旋（有序）和线圈（无序）间的可逆热转换,这两种状态具有共存现象。通过研究GP对巨噬细胞化学形态学影响及进行化学定量分析,初步探讨了GP对巨噬细胞激活的作用机理。研究表明巨噬细胞受到GP刺激进一步分化成熟,成为活化巨噬细胞,使细胞体积增大,活力增强,糖氧化作用和吞噬功能增加,促使细胞内溶菌酶大量增多,细胞内DNA、RNA、糖原体、ACPase、ANAE、ATPase和SDH等多种酶活性显著增强,并能明显增强SOD和O2-的活性。巨噬细胞膜上的非特异性受体通过其终端的-OH基与多糖-H基结合,启动了细胞内环化酶系统,使细胞的cGMP增加,致细胞内酶的分泌及活性增加,细胞代谢能力提高,奠定了巨噬细胞活化的基础。细胞因子是免疫细胞中重要的免疫因子,进一步从细胞因子的角度考察了GP对巨噬细胞的激活机理。结果证明当巨噬细胞培养48 h,在GP添加0-400μg/mL范围内,能剂量依赖地增加巨噬细胞中IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α和淋巴细胞中IL-2的分泌量,其中IL-6的分泌量最大。同样培养时间（0-72 h）也能明显影响细胞因子的分泌量,在72 h时分泌量最大。NO作为信息分子和细胞毒分子的双重因子,通过研究GP对NO、iNOS和核蛋白的影响证明:GP添加浓度和细胞培养时间对NO、iNOS和核蛋白的生成量都有明显的影响,随着GP添加浓度的增加和细胞培养时间延长,NO、iNOS和核蛋白的生成量明显增加。GP与LPS/IFN-γ协同实验证明:GP与LPS/IFN-γ协同增加NO和iNOS分泌量,并明显高于相应的单独添加GP组。用LPS预刺激巨噬细胞,再加入GP产生的NO、iNOS和核蛋白量以及增加趋势明显高于同时添加LPS和GP产生的量。巨噬细胞抗肿瘤、抗病毒、抑制胞内病原体增殖等作用主要通过NO的释放完成的。mRNA是联结基因与表达产物之间的桥梁,基因活化的直接结果是mRNA转录的增加,而蛋白质的合成依赖于mRNA的翻译。采用RT-PCR方法研究GP对巨噬细胞IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12p35、iNOS、TNF-α的mRNA表达情况,进一步证实GP直接影响蛋白质代谢,可在转录水平和翻译水平调节蛋白质合成,验证GP通过促进细胞因子的基因表达来促进机体的免疫调节功能可能是其免疫激活的机理之一。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 多糖的研究领域及研究中存在的问题

1.1.1 多糖的结构测定

1.1.2 多糖的构―效关系

1.1.3 多糖在体内的作用机制

1.1.4 多糖的天然含量少，合成困难

1.2 植物多糖的分离纯化

1.2.1 多糖的提取

1.2.2 多糖的纯化

1.2.3 多糖纯度的鉴定

1.2.4 多糖相对分子量的测定方法

1.3 多糖的生物活性

1.3.1 提高机体的免疫调节

1.3.2 多糖的抗肿瘤作用

1.3.3 多糖的降血糖作用

1.3.4 多糖的抗病毒作用

1.3.5 多糖的抗氧化作用

1.4 功能性多糖免疫调节机理

1.4.1 对钙离子传导的影响

1.4.2 对CAMP、CGMP 含量的影响

1.4.3 对一氧化氮（NO）的影响

1.4.4 多糖受体对机体免疫影响

1.5 甘草及甘草多糖的研究进展

1.5.1 甘草的研究概况

1.5.2 甘草的药理研究

1.5.3 GP 的提取

1.5.4 GP 的化学研究

1.5.5 GP 的药理学研究

1.6 本论文的目的和意义

1.7 本论文的主要内容和试验路线图

参考文献

第二章甘草多糖的提取与纯化

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 试验地点

2.2.2 试验材料

2.2.3 试验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 测定GP 含量的标准曲线

2.3.2 影响GP 提取的单因素试验

2.3.3 响应面分析优化GP 的最佳提取工艺

2.3.4 影响GP 分离析出的因素

2.3.5 GP 的初步纯化特点

2.3.6 DEAE-52 柱层析纯化GP

2.3.7 SEPHADEX G-200 柱层析纯化GP

2.3.8 GP 的柱层析纯化特点

2.3.9 GP 的纯度鉴定

2.3.10 GP 的理化性质鉴定

2.4 本章小结

参考文献

第三章甘草多糖的组成及结构分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 试验地点

3.2.2 试验材料

3.2.3 试验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 GP 的相对分子量测定

3.3.2 GP 中单糖组成初步分析（硅胶层析法）

3.3.3 气相色谱法测定GP 的单糖组成

3.3.4 红外光谱（IR）法分析GP 的结构

3.3.5 原子力显微镜观察GP 的结构

3.4 本章小结

参考文献

第四章甘草多糖对巨噬细胞内若干酶的活力及02-产生的影响

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 试验地点

4.2.2 试验材料

4.2.3 试验方法

4.2.4 统计分析

4.3 结果与分析

4.3.1 GP 对巨噬细胞外部形态变化的影响

4.3.2 GP 对腹腔巨噬细胞中核酸、糖原和SDH 的影响

4.3.3 GP 对腹腔巨噬细胞中ACPASE、ATPASE 和ANAE 的影响

4.3.4 GP 对腹腔巨噬细胞内LSZ 和SOD 活力的影响

4.3.5 GP 对巨噬细胞内02-产生的影响

4.4 本章小结

参考文献

第五章甘草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞因子的影响

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 试验地点

5.2.2 试验材料

5.2.3 试验方法

5.2.4 统计分析

5.3 结果与分析

5.3.1 GP 对巨噬细胞吞噬能力的影响

5.3.2 GP 对巨噬细胞能量代谢水平的影响

5.3.3 GP 对巨噬细胞分泌IL-1 的影响

5.3.4 GP 对巨噬细胞分泌IL-6 的影响

5.3.5 GP 对巨噬细胞分泌IL-12 的影响

5.3.6 GP 对巨噬细胞分泌TNF-Α的影响

5.3.7 GP 对小鼠脾淋巴细胞分泌因子IL-2 的影响

5.3.8 讨论

5.4 本章小结

参考文献

第六章甘草多糖对巨噬细胞中NO 和INOS 的影响

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 试验地点

6.2.2 试验材料

6.2.3 试验方法

6.2.4 统计分析

6.3 结果与分析

2^-含量标准曲线'>6.3.1 NO₂^-含量标准曲线

6.3.2 蛋白质浓度的标准曲线

6.3.3 GP 添加浓度对巨噬细胞中NO、INOS 和核蛋白影响

6.3.4 培养时间对巨噬细胞中NO、INOS 和核蛋白的影响

6.3.5 GP 对LPS 诱导的巨噬细胞中NO、INOS 和核蛋白的影响

6.3.6 GP 和LPS 对巨噬细胞中NO 和INOS 的协同影响

6.3.7 GP 和IFN-Γ对巨噬细胞中NO 和INOS 的协同影响

6.3.8 PB 对巨噬细胞中NO 和INOS 的抑制作用

6.3.9 讨论

6.4 本章小结

参考文献

第七章甘草多糖对巨噬细胞因子MRNA 表达的影响

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.2.1 试验地点

7.2.2 试验材料

7.2.3 试验方法

7.3 结果与分析

7.3.1 提取总RNA 纯度的确定

7.3.2 GP 对巨噬细胞IL-1ΒMRNA 表达的影响

7.3.3 GP 对巨噬细胞IL-1ΑMRNA 表达的影响

7.3.4 GP 对巨噬细胞IL-6 MRNA 表达的影响

7.3.5 GP 对巨噬细胞IL-12 P35 MRNA 表达的影响

7.3.6 GP 对巨噬细胞INOS MRNA 表达的影响

7.3.7 GP 对巨噬细胞TNF-ΑMRNA 表达的影响

7.3.8 GP 对巨噬细胞Β-ACTIN MRNA 表达的影响

7.4 本章小结

参考文献

主要结论

论文创新点

攻读博士期间发表的论文

致谢

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