猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白NSP4结构与功能的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒,其基因组大小为15kb左右。PRRSV基因组包含9个开放开放阅读框,分别编码病毒的复制酶（ORF1a和1b）,4个膜相关的糖蛋白（ORFs 2a至5）,2个非糖基化的膜蛋白（ORF2b and ORF6）,和N蛋白（ORF7）。PRRSV的复制酶被至少3个由病毒自身编码的蛋白酶酶解。通过氨基酸序列的比对分析,非结构蛋白NSP4被推测具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,并使用His39-Asp64-Ser118作为催化三联体。此外,推测PRRSV NSP4的底物结合区包括Thr113、His133等氨基酸残基。这两个氨基酸残基在3C样半胱氨酸蛋白酶中也是保守的,并负责酶对底物切点（Gln/Glu）↓（Gly/Ala/Ser）的特异性。 为了研究PRRSV NSP4的生化特性和结构特征,在大肠杆菌表达系统中表达了野生型NSP4、突变体H39R、突变体D64V、突变体S118Y、突变体H133L以及N末端截短型NSP4、C末端截短型NSP4,并经镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的重组表达蛋白。对纯化的重组表达蛋白进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,结果表明这些重组蛋白在大肠杆菌系统中获得正确的表达。利用合成的多肽底物S（LGSLLEGAFRT）和反相高效液相色谱技术,建立了定性检测PRRSV NSP4酶活性的方法。利用该方法我们检测了NSP4野生型、突变型、末端截短型等重组表达蛋白的酶活性。野生型NSP4能在体外酶解多肽底物S,酶切产物经MALDI-TOF质谱测定其分子量,结果表明底物多肽S中的Glu↓Gly肽键被切断,从而得到了预期的产物。说明野生型NSP4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性。而4个NSP4突变体和2个末端截短型NSP4均不表现出3C样丝氨酸蛋白酶活性,说明His39、Asp64、Ser118、His133等氨基酸残基是PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶活性所必须的。从而证实了关于His39-Asp64-Ser118组成PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶催化三联体以及His133是PRRSV NSP4底物结合位点的推测。同样,N末端和C末端氨基酸残基也都是PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶活性所必须的。 分子筛层析和SDS-PAGE分析表明PRRSV NSP4在体外的溶液中存在着大量的聚体,即使在浓度（0.2mg/ml）较低的条件下也有大量的二聚体生成,且有少量的三聚体。随着蛋白浓度的升高（2mg/ml）,聚体显著增多。推测二聚体是PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶的主要活性形式。N末端截短型NSP4在体外主要以三聚体形式存在,即使在低浓度（0.2mg/ml）条件下也是如此。C末端截短型NSP4在体外主要以单体形式存在,即使在高浓度（2mg/ml）条件下也是如此。这个结果表明C末端对于PRRSV NSP4单体的二聚化是必须的,它在酶单体二聚化过程中起着关键作用。猜测N末端对PRRSV NSP4二聚体起稳定作用,防止NSP4单体的三聚化或多聚化。 使用圆二色光谱仪对PRRSV NSP4野生型、突变型、末端截短型等重组表达蛋白的二级结构进行研究。结果表明NSP4以β折叠为主要的结构特征,点突变H39R、D64V、S118Y、H133L都对PRRSV NSP4结构有不同程度的影响。N末端或C末端截短对PRRSV NSP4的二级结构构成产生了显著的影响,使PRRSV NSP4的二级结构成为混合型的结构。这表明N末端和C末端序列都是PRRSV NSP4维持正常构象所必须的。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合症病原学研究进展
• 1.1.1 病毒起源之说
• 1.1.2 病毒的分类地位
• 1.1.3 病毒的形态与发生
• 1.1.4 病毒的培养与细胞受体
• 1.1.5 致病机理
• 1.1.6 PRRSV基因组
• 1.1.7 PRRSV在猪体内的分布
• 1.2 巢状病毒3C样蛋白酶研究进展
• 1.2.1 命名
• 1.2.2 同源性分析
• 1.2.3 活性中心
• 1.2.4 底物酶切位点的特异性
• 1.2.5 巢状病毒主要蛋白酶的3D结构
• 1.3 研究目的与意义
• 第二章 PRRSV非结构蛋白NSP4及其突变体的克隆与表达
• 2.1 前言
• 2.2 材料与试剂
• 2.2.1 病毒
• 2.2.2 载体、引物与菌株
• 2.2.3 工具酶与试剂
• 2.2.4 主要溶液与培养基配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 病毒
• 2.3.2 病毒RNA的提取
• 2.3.3 RT-PCR
• 2.3.4 DNA片断的回收
• 2.3.5 限制性酶切消化
• 2.3.6 DNA片断和载体的连接
• 2.3.7 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞
• 2.3.8 高效感受态细胞制备方法
• 2.3.9 常规转化法
• 2.3.10 菌落PCR鉴定
• 2.3.11 质粒DNA的小量制备
• 2.3.12 质粒的酶切鉴定
• 2.3.13 基因测序
• 2.3.14 细菌的培养及菌种保存
• 2.3.15 重叠延伸法定点诱变PRRSV NSP4基因
• 2.3.16 重组蛋白的诱导表达
• 2.3.17 菌体的收获和破碎
• 2.3.18 重组表达蛋白的纯化
• 2.3.19 重组表达蛋白的WESTERN-BLOT分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 PRRSV NSP4基因的RT-PCR扩增
• 2.4.2 重叠延伸法定点诱变PRRSV NSP4基因
• 2.4.3 菌落PCR鉴定
• 2.4.4 重组表达质粒的酶切鉴定
• 2.4.5 重组表达质粒的DNA序列测定
• 2.4.6 诱导表达和纯化
• 2.4.7 重组表达蛋白的Western-blot鉴定
• 2.5 讨论
• 第三章 PRRSV非结构蛋白NSP4生化特性的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 储备液、实验溶液
• 3.2.3 仪器设备
• 3.2.4 蛋白质浓度的测定
• 3.2.5 底物多肽的酶切
• 3.2.6 酶切产物的HPLC分析
• 3.2.7 酶切产物的质谱分析
• 3.2.8 重组表达蛋白的的分子筛层析分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 底物多肽酶切产物的HPLC分析
• 3.3.2 质谱分析
• 3.3.3 重组表达蛋白的的分子筛层析分析
• 3.4 讨论
• 第四章 PRRSV非结构蛋白NSP4结构的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 圆二色光谱的测定
• 4.2.2 PRRSV NSP4氨基酸序列BLAST
• 4.2.3 PRRSV NSP4三维结构的同源模建
• 4.2.4 PRRSV NSP4 3D模型结构合理性的评估
• 4.2.5 PRRSV NSP4 3D模型结构相似性搜索
• 4.2.6 PRRSV NSP4 3D模型与马动脉炎病毒NSP4 3D结构的叠合
• 4.2.7 PRRSV NSP4 3D模型与底物多肽的分子对接
• 4.3 结果
• 4.3.1 PRRSV NSP4圆二色光谱的测定
• 4.3.2 PRRSV NSP4氨基酸序列的BLAST
• 4.3.3 PRRSV NSP4的3D模型
• 4.3.4 PRRSV NSP4 3D模型结构合理性的评估
• 4.3.5 PRRSV NSP4 3D模型结构相似性搜索
• 4.3.6 PRRSV NSP4 3D模型与EAV NSP4 3D结构的叠合
• 4.3.7 PRRSV NSP4 3D模型与底物多肽的分子对接
• 4.4 讨论
• 第五章 研究总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介