拉米夫定对人乙肝病毒相关肝癌细胞放射敏感性的影响及机制研究

论文摘要

目的:研究抗病毒剂拉米夫定对人乙肝病毒相关肝癌细胞株HepG2.2.15细胞的放射增敏作用，并初步探索其可能的增敏机制。方法:通过荧光定量PCR法检测不同浓度拉米夫定（0，2.5，5，10，25μg/mL）对人乙肝病毒相关肝癌HepG2.2.15细胞的病毒抑制效果；采用平板克隆形成实验观察拉米夫定对HepG2.2.15细胞株放射敏感性的影响；运用流式细胞仪检测HepG2.2.15细胞的凋亡率及细胞周期分布变化；利用RT-PCR法、细胞免疫组化法及Western Blot法分别检测CyclinD1在HepG2.2.15细胞中表达水平的变化。结果:荧光定量PCR法检测结果显示，拉米夫定可抑制HepG2.2.15细胞内乙肝病毒的复制，且在10μg/mL作用48h时抑制效果最佳；平板克隆形成实验显示拉米夫定可显著降低照射后HepG2.2.15细胞的克隆形成率，其放射增敏比（SER）为1.224；流式细胞仪检测显示拉米夫定联合照射作用HepG2.2.15细胞后表现为凋亡率增加，G0/G1期细胞比例增多（p＜0.05）；拉米夫定联合照射后，细胞内CyclinD1mRNA及CyclinD1蛋白的表达水平均下调。结论:抗病毒剂拉米夫定在体外抑制乙肝病毒复制的同时能增强HepG2.2.15细胞的放射增敏感性，其增敏机制可能与拉米夫定下调CyclinD1表达引起G0/G1期阻滞及增强放射诱导的细胞凋亡有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第1章 引言
• 第2章 材料
• 2.1 细胞株
• 2.2 主要试剂
• 2.2.1 细胞培养所需主要试剂
• 2.2.2 荧光定量 PCR 法所需主要试剂
• 2.2.3 平板克隆形成实验所需主要试剂
• 2.2.4 流式细胞仪检测术所需主要试剂
• 2.2.5 RT-PCR 法所需主要试剂
• 2.2.6 细胞免疫组化法所需主要试剂
• 2.2.7 Western Blot 法所需主要试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 第3章 方法
• 3.1 细胞培养
• 3.1.1 细胞复苏
• 3.1.2 细胞换液
• 3.1.3 细胞传代
• 3.1.4 细胞冻存
• 3.1.5 绘制细胞生长曲线
• 3.2 细胞照射方法
• 3.3 荧光定量 PCR 法确定最佳药物浓度及作用时间
• 3.4 平板克隆形成实验观察拉米夫定对细胞放射敏感性的影响
• 3.5 流式细胞仪检测 HepG2.2.15 细胞的凋亡率变化
• 3.6 流式细胞仪检测 HepG2.2.15 细胞周期分布变化
• 3.7 RT-PCR 法检测细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）mRNA 的表达变化
• 3.7.1 提取各组细胞总 RNA
• 3.7.2 将细胞总 RNA 逆转录成 cDNA
• 3.7.3 PCR 扩增
• 3.7.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3.8 细胞免疫组化法初步检测各组细胞内 CyclinD1 蛋白的表达
• 3.9 Western blot 法检测各组细胞内 CyclinD1 蛋白的表达变化
• 3.9.1 细胞蛋白提取
• 3.9.2 SDS-PAGE 电泳
• 3.9.3 转膜
• 3.9.4 免疫反应
• 3.9.5 化学发光，显影，定影
• 3.9.6 凝胶图象分析
• 3.10 统计学分析
• 第4章 结果
• 4.1 MTT 法绘制 HepG2.2.15 细胞生长曲线
• 4.2 拉米夫定对 HepG2.2.15 细胞病毒复制的影响
• 4.3 拉米夫定对 HepG2.2.15 细胞放射敏感性的影响
• 4.4 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率变化
• 4.5 流式细胞仪检测各组细胞的周期分布变化
• 4.6 HepG2.2.15 细胞经不同处理后 CyclinD1mRNA 的表达变化
• 4.7 HepG2.2.15 细胞经不同处理后 CyclinD1 蛋白的表达变化
• 第5章 讨论
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献