线虫寿命相关基因网络的构建及营养素对网络状态的影响

论文摘要

衰老和长寿是人类科学研究面临的最艰难复杂的课题之一,衰老是基因和外界环境两方面共同作用的结果。其中,基因是决定细胞衰老,组织器官衰老、系统衰老和机体整体衰老的内在关键因素。如何调控衰老相关基因的活性状态,从衰老的源头上主动性干预,减缓或逆转衰老的启动和发展进程,是本课题研究的关键。本文通过对目前已经证实的线虫长寿基因进行整理和分析,将这些基因构建成线虫长寿局部基因网络。从基因网络的角度研究可全面地反映生命现象本身的内在规律优于以往孤立地研究单个基因。试验选用线虫作为模式生物,一共选用2个方案喂养线虫。分别为不同种类的乳酸菌和支链氨基酸及其组合。建立了利用不同营养物质喂养线虫的模式,并筛选出能够使线虫长寿的最优组合。利用实时定量PCR检测利用最优组合喂养的线虫在生长的多个阶段的基因表达变化,所选用的基因均为所构建的线虫局部长寿基因网络中的基因。更加直观的说明外界环境对于长寿网络的影响,对各个基因之间的相互作用情况也可以有一个初步的了解。当然,当前对于复杂生物性状的研究还没有固定的研究策略和方法,众多环境因素和敏感基因的相互作用都可对生物性状的发生产生影响,这个过程也将是一个动态循环的过程。试验结果表明,部分乳酸菌在NGM平板上不能够很好的生长,这给线虫的存活及转移带来的困难。试验中直接去除了这些菌种。最终确定喂养线虫的菌种一共有11株,分别为1号、5号、8号、1936号、119-10号、6-3-1号、6-3-2号、7-3-1号、7-3-2号、6-4号、7-4。在所测试的11株乳酸菌种,并不是所有的乳酸菌对寿命都有作用,仅仅有4株对线虫的寿命产生了影响。分别为1936号、6-3-2号、6-4号、7-4号,并且所有的乳酸菌种对线虫的寿命影响并没有体现在对线虫最大寿命的延长上,而是体现在可以降低线虫前期的死亡率上。第二种营养素为支链氨基酸,营养素直接加入培养基中,依旧采用E.coli OP50来喂养线虫。氨基酸一共选用3种,分别为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸,每种氨基酸用3中浓度测试,分别为0.1倍浓度、1倍浓度、10倍浓度。随后从中选出每种氨基酸的最优浓度进行组合试验。试验结果表明支链氨基酸组合的长寿效果并没有优于单个支链氨基酸对线虫寿命的影响。在所有测试的营养素及组合的试验中,以0.1倍缬氨酸的效果最好。并且这种效果也并不仅仅表现在对线虫最大寿命的延长上,同时也表现在对线虫整个生命周期死亡率的降低上。通过实时定量PCR对缬氨酸代谢周围的14个基因进行表达量的分析,结果表明sptl-2、cyp-33E1、C16A3.10、odc-1、C2.8H8.11、alh-13这6个基因的表达量上升。unc-25基因的表达量下降。C05D2.3基因在不同的阶段有不同的效果,在前期表达量下降,在中期表达量提高。从不同的基因变化差异上,我们可以进一步推断与长寿相关基因的功能及其与长寿的相关程度。还可以推测那些没有被报道的基因可能是长寿的敏感基因,为后续的研究打下基础。通过构建长寿基因表达量的数据库,也可以对线虫的长寿检测提供数据支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 研究目的及意义
• 1.3 国内外研究进展
• 1.3.1 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）
• 1.3.2 乳酸菌和支链氨基酸增强寿命的研究
• 1.3.3 生物小分子
• 1.3.4 长寿局部基因网络
• 1.3.5 实时荧光定量PCR
• 1.4 课题来源和研究内容
• 1.4.1 课题来源
• 1.4.2 研究内容
• 第2章 秀丽隐杆线虫的饲养与保存
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 线虫的饲养
• 2.2.3 线虫形态观察
• 2.2.4 线虫的冻存
• 2.2.5 线虫的同步化
• 2.3 试验结果与分析
• 2.3.1 线虫的形态学观察
• 2.3.2 线虫的同步化
• 第3章 线虫长寿基因网络的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 使用到的生物信息学数据库
• 3.2.2 课题中用到的软件
• 3.3 长寿局部基因网络的构建
• 3.3.1 基因的归纳整理
• 3.3.2 构建复杂生物性状局部基因网络
• 3.3.3 试验结果
• 3.3.4 讨论与分析
• 第4章 乳酸菌对线虫寿命的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验动物
• 4.2.2 试验菌株
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 线虫的寿命测定
• 4.2.5 线虫计数方法
• 4.2.6 线虫寿命分析方法
• 4.3 试验结果与分析
• 4.4 讨论
• 第5章 生物小分子对线虫寿命影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验动物
• 5.2.2 试验菌株
• 5.2.3 培养基
• 5.2.4 线虫寿命的测定
• 5.2.5 线虫计数方法
• 5.2.6 线虫寿命分析方法
• 5.3 试验结果与分析
• 5.3.1 支链氨基酸A对线虫寿命的影响
• 5.3.2 支链氨基酸B对线虫寿命的影响
• 5.3.3 支链氨基酸C对线虫寿命的影响
• 5.3.4 支链氨基酸组合对线虫寿命的影响
• 5.4 讨论
• 第6章 Q-PCR检测线虫基因表达水平
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验试剂及仪器
• 6.2.2 样品的采集
• 6.2.3 样品总RNA的提取
• 6.2.4 RNA的质量验证
• 6.2.5 cDNA的制备
• 6.2.6 引物设计
• 6.2.7 实时荧光PCR检测线虫基因表达变化
• 6.3 试验结果与分析
• 6.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢