TSA与5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用

论文摘要

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）与组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）是两种表观修饰剂,在体细胞克隆中用于对供体细胞或胚胎进行重编程,参与DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、染色质重塑等过程,使核移植胚的表观重编程更充分,提高体细胞克隆效率；低浓度的TSA处理孤雌胚能够促进胚胎的发育能力,但这两种抑制剂在牛孤雄胚中的作用尚未见报道。本研究利用TSA与5-aza-dc分别处理牛孤雄胚,观察这两种抑制剂对牛孤雄胚早期体外发育的作用；同时优化这两种抑制剂的处理条件（处理浓度、处理时间及处理阶段）；在此基础上,检测TSA处理后组蛋白H3的乙酰化水平及参与表观重编程的基因的相对表达量,进一步分析TSA对牛孤雄胚体外发育的作用机制,研究结果如下：1.TSA对早期牛孤雄胚体外发育的作用培养液中添加浓度为0（对照）、5、10、15、20和50nmol/L的TSA,在重构胚激活后培养孤雄胚15h,然后用未添加TSA的培养液继续培养,分析TSA对孤雄胚体外发育的作用及其与浓度的关系。结果发现,在培养液中添加TSA有利于孤雄胚的发育,最适浓度为5nmol/L,表现为卵裂率（80.6%）、16-细胞期胚胎率（46.8%）、桑椹胚率（29.0%）及囊胚率（12.9%）最高（P<0.05）。用含TSA 10 nmol/L的培养液在重构胚激活后培养孤雄胚0、10、15、20和25h,比较TSA作用时间对孤雄胚体外发育的影响。结果发现,培养15h和20h的胚胎卵裂率、16-细胞期胚胎率和囊胚率均显著高于对照组（P<0.05）。说明TSA作用15h或20h对牛孤雄胚的早期体外发育效果最佳,而作用时间不足或过长均不利于牛孤雄胚的早期体外发育。在TSA处理过程中设计三个处理时期,即休整期（激活前2h开始处理）、激活期（激活开始处理）与培养期（激活完成后开始处理）,TSA的处理浓度均为10nmol/L,总的作用时间均为15h,对照组未添加TSA。结果显示,不同的处理阶段对卵裂率、16-细胞期胚胎率及桑椹胚率影响不明显（P>0.05）；在囊胚率方面,培养期处理组囊胚率达到9.7%,显著高于其它各组（9.7% vs.0.0% P<0.05）。说明TSA在培养期处理牛孤雄胚具有较好的效果。2.5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用培养液中添加浓度为0（对照）、0.1、1和10nmol/L的5-aza-dc,在重构胚激活后培养孤雄胚24h,比较5-aza-dc浓度对孤雄胚体外发育的影响。不同浓度（0.1、1、10nmol/L）的处理组间在卵裂率、16-细胞期胚胎率、桑椹胚率及囊胚率方面差异不显著（P>0.05）,但均高于对照组；1 nmol/L处理组胚胎卵裂率显著高于对照组（78.8%vs.60.7% P<0.05）,且囊胚率达到7.6%,高于其它各组,表明1nmol/L的5-aza-dc是最佳的处理浓度。用含5-aza-dc 1 nmol/L的培养液在重构胚激活后培养孤雄胚0、15、24和48h,比较5-aza-dc作用时间对孤雄胚体外发育的影响。结果发现,培养24h的胚胎卵裂率、桑椹胚率和囊胚率均显著高于对照组（P<0.05）,但与其它处理组（15h和48h）间差异不显著（P>0.05）；在囊胚率方面24h处理组显著高于对照组与15h处理组（P<0.05）。3.TSA对组蛋白乙酰化水平及表观修饰相关基因表达的影响利用组蛋白H3抗体检测组蛋白乙酰化水平,设计四个组,两个对照组（孤雄组与孤雌组）与两个TSA处理组（5nmol/L,20nmol/L）,处理时间为胚胎培养期作用15 h,检测体外培养2-5d的胚胎。结果发现,不同浓度（Onmol/L,5nmol/L,20nmol/L）的TSA处理对组蛋白H3的乙酰化水平影响不明显,但均低于同一时期的孤雌胚胎的乙酰化水平；同一处理组（0nmol/L或5nmol/L或20nmol/L）不同发育阶段的胚胎,组蛋白H3的乙酰化水平存在差异,表明孤雄胚的乙酰化水平低于孤雌胚,且随着胚胎发育的进行组蛋白的乙酰化水平逐渐增强。牛孤雄重构胚激活后,用含0、5和20 nmol/L TSA的培养液培养15h,提取胚胎RNA,应用荧光定量PCR方法检测组蛋白去乙酰化酶基因（HDAC1, HDAC2）、乙酰基转移酶基因HAT1与DNA甲基转移酶基因（DNMT3a, DNMT3b, DNMT1）的表达量,发现用TSA处理后,上述所有去乙酰化酶基因和DNA甲基转移酶基因的表达量均下降,且抑制作用随TSA浓度的增加而增强（P<0.05）。基因HAT1在TSA处理后的表达量也低于对照组（P<0.05）。结果表明,TSA能够抑制牛孤雄胚组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基转移酶基因的表达,但并不能促进HAT1基因的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）
• 1.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂的分类
• 1.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）的作用机制
• 1.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）与组蛋白乙酰化修饰及染色质重塑
• 1.3.1 组蛋白乙酰基转移酶与组蛋白去乙酰化酶
• 1.3.2 组蛋白乙酰化的作用
• 1.3.3 TSA与组蛋白乙酰化及染色质重塑
• 1.4 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）的研究进展
• 2 DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）
• 2.1 DNA甲基转移酶抑制剂的分类
• 2.2 DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）的作用机制
• 2.3 DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）与DNA甲基化
• 2.3.1 DNA甲基化
• 2.3.2 DNA甲基化表观重编程
• 2.3.3 DNA甲基化与胚胎发育
• 2.3.4 5-aza-dc与DNA甲基化重编程
• 2.4 DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）的研究进展
• 3 哺乳动物孤雄生殖研究进展
• 3.1 哺乳动物孤雄生殖研究的历史与现状
• 3.2 哺乳动物孤雄胚胎构建的方法
• 3.2.1 原核移植法构建孤雄胚
• 3.2.2 体外受精法构建孤雄胚
• 3.2.3 单精注射法构建孤雄胚
• 3.2.4 体外受精结合原核移植法构建孤雄胚
• 3.3 哺乳动物孤雄胚胎发育的瓶颈
• 3.3.1 母源基因组在胚胎发育中是必不可少的
• 3.3.2 基因印记
• 3.3.3 X染色体失活
• 3.4 哺乳动物孤雄胚的应用前景
• 3.4.1 在基础研究中的应用
• 3.4.2 在医学领域中的应用
• 3.4.3 在畜牧业中的应用
• 第二章 TSA对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 1 前言
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验主要药品与试剂
• 2.1.2 试验主要仪器设备
• 2.1.3 试验操作液
• 2.1.4 显微操作针的准备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试验设计
• 2.2.2 卵巢的采集与保存
• 2.2.3 卵母细胞的收集
• 2.2.4 卵母细胞的体外成熟培养
• 2.2.5 卵母细胞的准备
• 2.2.6 精子的处理与准备
• 2.2.7 卵母细胞的去核
• 2.2.8 孤雄胚的构建
• 2.2.9 孤雄胚的激活处理及体外培养
• 3 数据统计
• 4 结果与分析
• 4.1 TSA浓度对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 4.2 TSA作用时间对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 4.3 TSA处理阶段对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 5 讨论
• 5.1 TSA浓度对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 5.2 TSA作用时间对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 5.3 TSA处理阶段对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 6 结论
• 第三章 5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 1 前言
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验主要药品与试剂
• 2.1.2 试验主要仪器设备
• 2.1.3 试验操作液
• 2.1.4 显微操作针的准备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试验设计
• 2.2.2 试验方法
• 3 数据统计
• 4 结果与分析
• 4.1 5-aza-dc浓度对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 4.2 5-aza-dc作用时间对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 5 讨论
• 5.1 5-aza-dc浓度对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 5.2 5-aza-dc作用时间对早期牛孤雄胚体外发育的作用
• 6 结论
• 第四章 TSA对组蛋白乙酰化水平及表观修饰相关基因表达的影响
• 1 前言
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验主要药品与试剂
• 2.1.2 试验主要仪器设备
• 2.1.3 试验操作液
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试验设计
• 2.2.2 卵母细胞的孤雌激活
• 2.2.3 免疫荧光染色
• 2.2.4 荧光定量PCR
• 3 数据统计
• 4 结果与分析
• 4.1 TSA对牛孤雄胚组蛋白乙酰化水平的影响
• 4.2 TSA对牛孤雄胚表观修饰相关基因表达的影响
• 5 讨论
• 5.1 TSA对牛孤雄胚组蛋白乙酰化水平的影响
• 5.2 TSA对牛孤雄胚表观修饰相关基因表达的影响
• 6 结论
• 参考文献
• 附表
• 附图
• 致谢