一种基于荧光量子点标识技术的糖尿病易感基因通量筛选方法的基础研究

论文摘要

2型糖尿病是多种微效基因协同作用并与环境因素共同导致的多基因疾病,确定引起或诱发2型糖尿病的基因变异已经成为生物医学领域的焦点问题。目前建立的检测易感基因突变的方法,如RFLP、SSCP、Taq Man技术等只能检测单个基因突变,不能同时检测多个基因的变异情况,因此不适合用于如2型糖尿病这样的多基因疾病易感基因分析。而测序、高效液相色谱技术、基因芯片等方法虽然可以同时检测多个基因的SNP,但是由于它们需要昂贵的仪器,系统精密,对所用试剂和环境要求高等原因未能应用于临床大规模检测易感基因。因此,需要建立一种简便易行且经济的通量筛选技术。本课题应用等位基因特异性PCR,结合磁性纳米颗粒纯化技术和荧光量子点标记技术对同一体系内两个糖尿病易感基因的SNP进行结果判定,从而探讨在此基础上建立一种同时检测多个T2DM易感基因SNP方法的可行性。研究结果表明:在等位特异性引物3’末端倒数第二位引入错配碱基,结合降低反应体系中dNTP的浓度,可以大大提高AS-PCR反应的特异性。通过对100例T2DM患者和124例正常对照组UCP3基因-55C/T和脂联素基因+45T/G多态性的检测,证明此方法的灵敏性和特异性均可达到RFLP方法的检测水平。在等位特异性PCR的基础上,利用磁性纳米颗粒进行AS-PCR产物纯化,纯化产物变性后与两种量子点标记基因检测探针杂交,通过对杂交的量子点探针信号检测判定样品的基因型,实现在同一体系内同时对两个基因SNP进行检测;并且证实了用磁性纳米颗粒纯化AS-PCR产物可以提高检测的灵敏性,量子点标记基因检测探针可以解决通量检测的问题,为建立多色量子点标记探针筛选T2DM易感基因的方法奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩略语表
• 第一篇 文献综述
• 综述一 纳米材料在DNA 分析中的应用
• 1.1 磁性纳米颗粒在DNA 分离技术中的应用
• 1.2 量子点在DNA 分析中的应用
• 1.3 展望
• 综述二 2 型糖尿病遗传易感基因多态性研究进展
• 1.1 2 型糖尿病易感基因多态性研究策略
• 1.2 2 型糖尿病密切相关的候选基因
• 第二篇 实验研究
• 前言
• 第一章 等位特异性PCR 技术的优化
• 1.1 仪器与材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 UCP3 基因-55C/T 与脂联素基因+45T/G 多态性检测及其与T2DM 的关系
• 2.1 仪器与材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 磁性纳米颗粒和量子点的合成、修饰及其与DNA 的偶联
• 3.1 仪器与材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 基于荧光量子点标识技术的糖尿病易感基因多态性检测体系的建立
• 4.1 仪器与材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 研究结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract