桃褐腐病菌Cyt b基因1166bp内含子对G143A突变影响的分子机理初步研究

论文摘要

由链核盘菌（Monilina spp）引起的桃褐腐病是世界范围内桃园里的重要病害之一,而美澳型核果链核盘菌（M.fructicola）在我国许多桃产区均能采集得到,是我国的优势菌种。国内外用于防治该病主要采用苯丙咪唑类、麦角甾醇合成抑制剂和甲氧基丙烯酸酯类呼吸抑制剂这三大类杀菌剂。目前已经在田间发现了对前两类杀菌剂的抗性菌株,而呼吸抑制剂类抗性菌株尚未发现。通过克隆呼吸抑制剂类杀菌剂靶标基因Cyt b序列得知,在突变发生热点G413的编码序列GGT后存在一个1166bp内含子,是否由于该内含子的存在影响了G143A突变的发生而不能产生抗药性,本文就这个问题进行了初步探索。本文采用三种方法来探索该分子机理。首先是同源置换,采用PEG介导的原生质体转化进行两次敲除,将含有G143A突变引入到Cyt b基因中,检测该基因的转录和翻译。其次是插入突变,建立农杆菌介导的孢子转化体系,将含有G143A突变的Cytb基因插入到核基因组中,检测该基因的转录和翻译。最后是酵母异源表达,采用成熟的酵母表达体系,在酵母DNA中引入M. fructicola的Cyt b cDNA和G143编码基因后的内含子,检测该内含子正常剪切和G143A突变之间是否互相影响。本文首先研究了PEG介导的M. fructicola原生质体遗传转化体系,20μg/ml潮霉素浓度为对应菌株的最小抑制浓度（MIC）值。经优化得到了原生质体最佳制备条件：采用CM液体培养基+玻璃珠摇培3天,收集菌丝。用1.5mg/ml蜗牛酶（Snailase）和10mg/ml溶菌酶（Lysozyme）的酶组合酶解3h,能得到高质量的原生质体。在农杆菌介导的M. fructicola孢子遗传转化实验中,确认了M. fructicola孢子平均含有3-4个细胞核,并初步建立了农杆菌介导的M. fructicola孢子遗传转化体系。利用酵母表达体系,成功构建酵母表达质粒,将含有G143A突变的Cyt b基因连同1166bp的内含子转入酵母细胞DNA中,以野生型Cyt b基因连同1166bp的内含子转入酵母细胞DNA中的转化子作为对照,分别检测其对应的Cyt b基因成熟mRNA的合成,无论野生型还是突变型都无法剪切掉该内含子,外源基因无法在酵母细胞中剪切自身内含子。综述所述,针对1166bp内含子对G143A突变影响的研究,本文做了大量尝试和探索,为后续的研究打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1. 桃褐腐病研究进展
• 1.1 桃褐腐病及其危害
• 1.2 桃褐腐病菌的介绍
• 1.3 桃褐腐病害防治方法
• 1.4 国内外防治桃褐腐病害杀菌剂抗药性研究现状
• 2. PCR定点诱变
• 3. 真菌遗传转化方法
• 3.1 PEG介导的原生质体转化
• 3.2 限制性内切酶介导的遗传转化
• 3.3 农杆菌介导的遗传转化
• 4. 酵母表达系统的研究进展
• 4.1 酿酒酵母表达系统
• 4.2 甲醇营养型酵母表达系统
• 5. 本研究意义和目的
• 第二章. PEG介导的桃褐腐病菌原生质体转化
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 材料和仪器
• 1.1.2 试剂和培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 G143A体外定点突变
• 1.2.2 构建敲除载体
• 1.2.3 对潮霉素的MIC值的测定
• 1.2.4 配制酶解液
• 1.2.5 原生质体的制备
• 1.2.6 原生质体转化
• 2 结果与分析
• 2.1 敲除载体的构建和验证
• 2.2 原生质体转化
• 3. 小结与讨论
• 第三章 农杆菌介导的遗传转化体系
• 1. 材料与方法
• 1.1. 材料
• 1.1.1 材料和仪器
• 1.1.2 试剂和培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 构建载体
• 1.2.2 DAPI染色观察孢子细胞核
• 1.2.3 农杆菌电击感受态的制备
• 1.2.4 电转农杆菌
• 1.2.5 孢子收集
• 1.2.6 农杆菌转化
• 1.2.7 转化子的筛选
• 3. 结果与分析与分析
• 3.1 基因敲除载体的构建和验证
• 3.2 DAPI孢子染色结果
• 3.3 农杆菌介导的转化结果与分析
• 4. 小结与讨论
• 第四章 桃褐腐病菌基因酵母异源表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 材料和仪器
• 1.1.2 试剂和培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 构建表达质粒
• 1.2.2 质粒DNA准备
• 1.2.3 线性化质粒DNA
• 1.2.4 毕赤酵母电转化感受态细胞的制备
• 1.2.5 酵母电转化
• 1.2.6 筛选转化子
• 1.2.7 转化子的PCR验证
• 1.2.8 pNIC与pMIC转化子提RNA
• 1.2.9 RNA反转录获得cDNA
• 1.2.10 pNIC与pMIC转化子RNA检测
• 2. 结果与分析与分析
• 2.1 酵母表达质粒构建
• 2.2 酵母表达转化子获得和鉴定
• 2.3 pNIC与pMIC转化子mRNA的检测
• 3. 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录