论文题目: 拟南芥G蛋白信号转导调节蛋白（AtRGS1蛋白）功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 陈云
导师: 梁建生
关键词: 拟南芥,蛋白,脱落酸,突变体,转基因植株,转基因细胞
文献来源: 扬州大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究以拟南芥野生型Col-0、突变体rgs1-2和gpa1-3、悬浮培养细胞系为材料,通过突变体分析、转基因植株构建、转基因细胞系构建和原生质体瞬时表达等技术,用分子生物学、分子遗传学、生物化学等方法研究了AtRGS1蛋白在拟南芥信号转导网络途径中的作用。取得了以下主要研究结果:1、分析突变体rgs1-2的生理特性表明:(1)突变体rgs1-2种子萌发不需要春化作用,与野生型相比,后熟作用对rgs1-2种子萌发促进作用不明显;rgs1-2种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制作用不敏感,gpa1-3对葡萄糖和蔗糖的抑制作用表现为超敏感。且这种抑制作用与糖的渗透胁迫无关,而是由糖介导的信号转导途径引起的,且不依赖于已糖激酶途径;rgs1-2种子萌发对ABA低敏,gpa1-3对ABA超敏。不同基因型种子萌发对ABA响应差异主要是由于内源ABA水平的差异;rgs1-2种子内源ABA水平较低,ABA生物合成酶ABA2和NCED3的基因表达水平低,葡萄糖处理对rgs1-2两基因表达水平影响不显著。推断葡萄糖对种子萌发的抑制效应是通过提高内源ABA含量,且RGS1在此途径中作为一个重要的信号分子起调节作用。(2)葡萄糖与蔗糖抑制了Col黄化苗下胚轴生长,且葡萄糖抑制作用更明显,但不抑制rgs1-2黄化苗下胚轴生长;10%蔗糖作用下幼苗依然保持生长,6%甘露醇对幼苗主根生长作用比种子萌发更明显,表明糖对幼苗生长过程与种子萌发过程有着不同的调节机制。(3)植株水平,rgs1-2叶片气孔比Col大,气孔密度比Col小,离体叶片失水速率比Col快,植株表现比Col不耐旱。2、本实验用TOPO克隆的方法构建了35S-RGS1过表达体系,并分析了转基因植株生理特性:(1)RT-PCR结果表明,转基因植株内RGS1在不同组织器官表达都有所增加。过表达植株比野生型表现出一定的生长抑制和花期延长。(2)转基因种子萌发表现出对ABA超敏感性,在1μmol L-1 ABA上萌发的转基因幼苗绿苗率较低,在2μmol L-1 ABA上生长的转基因植株幼苗主根生长受明显抑制,RGS1过表达也增加了植株对ABA的敏感性。(3)转基因植株表现出高的抗旱能力,且能提高干旱复水后植株成活率和开花率。转基因植株叶片气孔比Col小,密度比Col大,离体叶片失水速率比Col低。(4)对ABA和干旱响应和/或调节的基因分析结果表明,RGS1过表达不同程度提高或降低了相关基因的表达水平。3、建立了拟南芥悬浮培养细胞体系并构建了转基因细胞系,结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术证明了RGS1蛋白定位于细胞膜,但ABA和其它处理可以改变RGS1的亚细胞定位,western blotting分析结果表明不同胁迫处理可以不同程度诱导AtRGS1蛋白表达。
论文目录:
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英文摘要
中英文对照词
第1章 文献综述
1. 动物中G蛋白信号转导系统
2. 植物中G蛋白信号转导系统
2.1 植物G蛋白信号组分
2.2 G 蛋白可能参与的植物细胞信号转导途径
2.2.1 G 蛋白信号在种子中
2.2.2 G 蛋白信号在根中
2.2.3 G 蛋白信号在茎中
2.2.4 胁迫响应
2.3 G 蛋白调节蛋白（RGS蛋白）
2.3.1 RGS 蛋白家族
2.3.2 RGS 作用的分子机理
2.3.3 RGS 蛋白的胞内定位
2.3.4 拟南芥RGS1 蛋白
3. 糖信号
3.1 糖在种子和胚胎生长发育过程中的作用
3.2 糖在种子萌发和早期幼苗生长过程中的作用
3.3 糖在成熟组织和器官形成中的作用
3.4 糖对生长发育周期的影响
3.5 糖调节基因的表达
4 ABA 信号
4.1 ABA 生物合成途径
4.2 ABA信号转导途径
4.3 遗传分析ABA信号转导途径
4.4 ABA在成熟种子萌发中的作用
4.5 ABA在幼苗生长中的作用
4.6 ABA 应答基因
5 本研究的目的及研究内容
参考文献
第2章 突变体 rgs1-2 功能特性分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 试剂
1.3 实验方法
2 结果与分析
2.1 突变体鉴定
2.2 突变体rgs1-2 表型分析
2.2.1 茎、叶、荚果形态特征
2.2.2 花期
2.3 RGS1 在拟南芥种子萌发中的作用
2.3.1 春化和后熟作用对种子萌发的影响
2.3.2 糖对种子萌发的影响
2.3.3 ABA 对种子萌发的影响
2.3.4 糖和ABA 相互作用对种子萌发的影响
2.3.5 GA 对种子萌发的影响
2.3.6 NaCl对种子萌发的影响
2.4 RGS1 在拟南芥种子萌发后生长中的作用
2.4.1 蔗糖与葡萄糖对rgs1-2 黄化苗下胚轴的影响
2.4.2 RGS1 在拟南芥幼苗根生长中的作用
2.4.2.1 不同类型糖对rgs1-2 幼苗主根生长的影响
2.4.2.2 ABA 对拟南芥幼苗根生长的影响
2.4.2.3 盐胁迫对拟南芥幼苗根生长的影响
2.4.2.4 PEG 对拟南芥幼苗根生长的影响
2.4.3 高浓度不同类型糖处理对rgs1-2 萌发后幼苗生长的影响
2.4.4 糖和ABA相互作用对rgs1-2萌发后幼苗生长的影响
2.5 RGS1 在拟南芥植株生长中的作用
2.5.1 RGS1 对干旱胁迫的响应
2.5.1.1 突变体植株对土壤干旱的响应
2.5.1.2 离体叶片失水速率
2.5.2 气孔特性
2.5.3 离体叶片气孔特性
2.5.4 ABA 对气孔的调控
3 讨论
参考文献
第3章 转基因植株功能特性分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 菌株、载体及生化试剂
1.3 实验方法
2 结果与分析
2.1 转基因植株构建
2.1.1 拟南芥幼苗cDNA 库的合成及RGS1 基因全长cDNA 序列的获得
2.1.2 AtRGS1 基因cDNA 的克隆与鉴定
2.1.3 农杆菌介导培育转基因拟南芥
2.1.4 转基因植株筛选
2.2 RGS1 过表达植株表型分析
2.3 AtRGS1 过表达植株功能分析
2.3.1 转基因植株对ABA 信号的响应
2.3.2 转基因植株对GA信号的响应
2.3.3 转基因植株对盐胁迫信号的响应
2.3.4 转基因植株对干旱胁迫信号的响应
2.3.4.1 转基因植株对干旱胁迫信号的响应
2.3.4.2 离体叶片对干旱胁迫信号的响应
2.3.4.3 气孔特性
2.3.4.4 离体叶片气孔特性
2.3.4.5 ABA 对气孔调控
2.3.5 转基因植株中相关基因表达分析
3 讨论
参考文献
第4章 AtRGS1 蛋白细胞水平功能分析
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 菌株、载体和生化试剂
1.3 实验方法
2 结果与分析
2.1 拟南芥悬浮培养细胞的建立
2.2 细胞转化
2.2.1 转化条件摸索
2.2.1.1 转化用细胞培养时间的选择
2.2.1.2 农杆菌浓度对基因转导的作用
2.2.1.3 壮观霉素抗性细胞团的选择
2.2.2 RGS1蛋白细胞定位
2.2.3 不同胁迫条件下RGS1表达和亚细胞分布变化
2.2.4 RGS1-GFP 融合蛋白在拟南芥细胞中表达的western-blotting 检测
2.3 原生质体瞬时表达
2.3.1 原生质体瞬时表达条件确定
2.3.2 RGS1 蛋白的原生质体定位
2.3.3 不同胁迫条件下RGS1分布变化
3 讨论
参考文献
第5章 结语
1 研究小结
2 本研究的创新点
3 深入研究设想
附录
攻读博士学位期间论文发表情况
致谢
发布时间: 2007-11-21
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