单个中性粒细胞中过氧化物酶、过氧化氢、活性氧的测定

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第一章是引言，对单细胞分析技术进行综述，将单细胞分析技术大致分为3类，一类是在微通道中分离检测，另一类是微探针检测，第三类是光学显微成像检测，然后分别对毛细管电泳、微流控芯片、超微电极、光纤传感器、扫描电化学显微镜、原子力显微镜、普通荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、激光全内反射显微镜、近场光学显微镜在单细胞分析中的应用加以介绍，并阐述了近年来兴起的高通量单细胞分析技术。本章共引用文献190篇。第二章建立了用酶动力学和落射显微荧光成像技术检测单个中性粒细胞内过氧化物酶（PO）活性的新方法。中性粒细胞内的过氧化物酶是一种催化剂，能够催化过氧化氢（H2O2）和10-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪（ADHP）的化学反应，反应生成具有强荧光的物质试卤灵。基于这一催化反应我们建立了单个中性粒细胞内过氧化物酶的检测方法，该方法有单细胞进样、细胞溶膜、催化反应、动力学检测等步骤。我们制作了单细胞进样器，单个中性粒细胞在电渗流作用下进入一根毛细管，再将细胞从毛细管转移到微池内。细胞在微池内经过冻融、超声振荡和低渗溶液作用溶解，细胞内PO均匀分散到溶液内，催化溶液中ADHP与H2O2反应生成试卤灵。我们用543 nm的He-Ne激光器作为激发光源对生成的试卤灵进行激发，产生的荧光被安置在倒置显微镜系统上的增强型电荷耦合装置（ICCD）检测到，用ICCD拍摄的荧光图像的校正平均灰度作为定量依据，通过平均灰度的随反应时间增长的速度来测定池内PO活性浓度，并根据活性浓度和池内溶液体积计算出单个中性粒细胞内PO的平均活性为3×10-8U／cell。该方法的检测下限为7×10-8U／mL。第三章利用落射荧光显微成像技术测定单个中性粒细胞中的H2O2。H2O2在细胞生命活动中发挥重要作用，但是目前的文献中没有对单个细胞溶膜后测定细胞内H2O2的报道。我们将单个中性粒细胞用自制的纳升注射器转移到微池内，经过冻融和低渗溶液作用使中性粒细胞溶解，细胞内H2O2释放出来与池中ADHP和HRP反应，生成试卤灵，用543nm激光激发试卤灵，产生的荧光用PMT检测，用标准曲线法测定微池内H2O2浓度，进而计算出细胞内H2O2含量。细胞内PO和过氧化氢酶对测定的干扰可以忽略。为了消除细胞内原有荧光物质

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第一章单细胞分析研究概况

1.1 单细胞分析的意义

1.2 微通道分离分析

1.2.1 毛细管电泳单细胞分析

1.2.2 微流控芯片单细胞分析

1.2.3 开管柱液相色谱

1.3 微探针技术分析单细胞

1.3.1 微探针直接单细胞分析

1.3.2 微探针扫描测定单细胞

1.4 荧光显微成像测定单细胞

1.4.1 一般荧光显微镜分析

1.4.2 激光共聚焦扫描显微术

1.4.3 激光全内反射显微术

1.4.4 扫描近场光学显微术

1.5 单细胞分析通量的提高

参考文献

第二章落射催化荧光图像法分析测定单个中性粒细胞内过氧化物酶

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验装置

2.2.2 材料、试剂及溶液配制

2.2.3 实验方法

2.2.3.1 微型化学检测池及恒温空气浴的制作

2.2.3.2 微升加液器的制作

2.2.3.3 催化荧光强度的动力学测定和图像分析

2.2.3.4 细胞提取用具的消毒，中性粒细胞提取

2.2.3.5 细胞提取液的制备

2.2.3.6 单细胞进样

2.2.3.7 单细胞溶膜

2.2.3.8 单细胞内PO的催化动力学检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 温度、pH和缓冲液浓度

2.3.2 激光功率的选择

2.3.3 酶的催化动力学曲线和dF/dt的测定

2.3.4 用HRP作为活性标准检测细胞内过氧化物酶的可行性

2.3.5 底物浓度的选择

2.3.6 ICCD工作模式的选择

2.3.7 曝光时间和增益（intensified gain）的选择

2.3.8 过氧化物酶活性分析的标准曲线和检测下限

2.3.9 标准曲线法测定中性粒细胞提取液中PO

2.3.10 标准曲线法检测单个中性粒细胞中PO

2.3.11 金属离子对单细胞酶活力分析的影响程度

2.4 结论

参考文献

第三章落射荧光显微术测定中性粒细胞内的过氧化氢

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验装置与试剂

3.2.2 反应-检测池的制作

3.2.3 微升进样器、检测池盖板、恒温空气浴的制做

3.2.4 器皿消毒，中性粒细胞的提取

3.2.5 纳升细胞注射器的制作

3.2.6 纳升移液器的加样和注射方法

2O₂标准溶液的孵育和荧光测定'>3.2.7 H₂O₂标准溶液的孵育和荧光测定

3.2.8 细胞提取液的制备

3.2.9 细胞提取液的荧光测定

3.2.10 单细胞测定

3.3 结果和讨论

3.3.1 温度和pH的选择

3.3.2 荧光试剂的选择

3.3.3 ADHP和HRP工作溶液浓度的选择

3.3.4 激光功率的选择

3.3.5 孵育时间的选择

3.3.6 中性粒细胞的破膜方法

2O₂的线性范围和检测下限'>3.3.7 H₂O₂的线性范围和检测下限

2O₂'>3.3.8 标准曲线法测定中性粒细胞提取液中H₂O₂

3.3.9 提取液测定过程中的干扰因素

2O₂'>3.3.10 标准曲线法检测单个中性粒细胞中H₂O₂

3.3.11 单细胞分析中的干扰因素

3.3.12 纳升移液器的测量重复性

参考文献

第四章利用纳升微池阵列芯片测定单个中性粒细胞内过氧化氢

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 检测装置

4.2.2 实验试剂与材料

4.2.3 微阵列池芯片的制造

4.2.4 微阵列池深度和容积的测定

4.2.5 纳升注射器的制作

4.2.6 水平推片封盖法

4.2.7 芯片上溶液荧光强度的连续测量

2O₂标准溶液的校正荧光强度测定'>4.2.8 H₂O₂标准溶液的校正荧光强度测定

4.2.9 中性粒细胞的提取和细胞计数

4.2.10 细胞提取液的制备

4.2.11 细胞提取液的分析

4.2.12 单细胞和反应试剂的进样

4.2.13 单细胞溶膜、分散混合、反应衍生、荧光检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 推片方式的选择

4.3.2 密封方式的选择

4.3.3 微池大小的选择

4.3.4 定量信号采集方式的选择

4.3.5 信号采集深度

4.3.6 微池的尺寸和体积

4.3.7 芯片上微池的标准曲线

4.3.8 细胞提取液测量结果

4.3.9 细胞自身荧光背景的影响

4.3.10 细胞悬浮液浓度的选择

4.3.11 单细胞分析结果

4.3.12 冷冻-融化过程中HRP催化活性损失

4.3.13 PMT负高压的调节

4.3.14 激光功率的选择

4.4 结论

参考文献

第五章纳升微池阵列芯片定量测定活中性粒单细胞受药物刺激后的活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）释放

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 微阵列池芯片及其检测装置

5.2.2 实验试剂与材料

5.2.3 器皿消毒方法

5.2.4 中性粒细胞提取、清洗和计数

5.2.5 标准溶液的分析

5.2.6 单细胞分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 PMA、ADHP、HRP浓度的选择

5.3.2 孵育时间的确定

5.3.3 标准溶液工作曲线

2O₂对H₂O₂释放测定的干扰'>5.3.4 细胞内H₂O₂对H₂O₂释放测定的干扰

2O₂对细胞存活率的影响'>5.3.5 细胞外H₂O₂对细胞存活率的影响

2O₂的影响'>5.3.6 推片前细胞释放H₂O₂的影响

5.3.7 细胞悬浮液的分析测量

5.3.8 单细胞释放测量结果

5.3.9 激光照射对中性粒细胞释放的影响

5.3.10 反应体系中的溶解氧

2O₂的产生途径'>5.3.11 中性粒细胞释放的H₂O₂的产生途径

5.3.12 PMT负高压的调整

5.3.13 激光功率的选择

5.4 结论

参考文献

第六章硼酸锂晶体串连式压电化学传感器的研究

6.1 引言

6.2 实验部分

6.3 结果与讨论

6.3.1 对溶液电导率的响应

6.3.2 对溶液介电常数的响应

6.3.3 有机溶剂中微量水分的快速测定

6.4 结论

参考文献

致谢

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