水杨酸诱导下人参培养物差异表达基因片段的克隆

论文摘要

本实验以2年生人参根为外植体,采用MS+2,4-D（4.0mg/L）培养基中诱导形成愈伤组织,在MS+2,4-D（2.0mg/L）+BA（2.0mg/L）+IBA（5.0mg/L）+Vc（30mg/L）的培养基质中进行悬浮培养,在细胞悬浮培养物生长的第7d、14d、21d、28d添加10-3mg/L水杨酸,再次证实了在人参细胞的生长对数期添加水杨酸可提高人参细胞培养物中人参皂苷的含量,与对照相比可提高130%,而在细胞生长的早期添加水杨酸对细胞培养物中的皂苷含量影响不大。同时本实验观察得到,水杨酸的添加可以延长人参愈伤组织的培养周期,与未添加水杨酸的人参愈伤组织相比,在愈伤组织培养的第35天,添加水杨酸的人参愈伤组织仍然处于生长旺盛阶段,而未添加水杨酸的人参愈伤组织进入衰退期。本实验跟踪了水杨酸添加后过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶三种酶在72小时内的变化。结果表明过氧化物酶的活力在24小时达到最高峰值,其活性可达到对照的1.5倍,随后活性开始下降,72小时后与对照基本接近。多酚氧化酶的活力在第18小时达到最大并且其活力在72小时之内高于对照。苯丙氨酸解氨酶的活力在24小时后迅速攀升在48小时苯丙氨酸解氨酶的活力达到最大峰值,为对照的1.87倍。这三种酶活性的提高在一定程度上表征了细胞次级代谢的增强,有利于次生代谢产物的合成和积累。水杨酸作为诱导子,已在多种药用植物细胞培养中使用,效果显著。但水杨酸作为诱导子诱导植物次生代谢产物合成的作用机制并不十分清楚。本实验首次将cDNA-RDA技术应用到药用植物次生代谢的研究中,优化了cDNA-RDA技术体系。确定了在添加水杨酸后提取总RNA的时间为添加后第24小时,置换合成双链cDNA,合成3对接头引物,筛选差异片段。经差异显示分析得到一个长为516bp的差异表达片段,通过查询国际互联网与GenBank库中的核苷酸序列,没有发现该基因的同源序列,因此我们认定这是一差异表达的cDNA序列可能来自一条未曾分离的新基因,GenBank中的注册号为FE900130。其中差异片段的前217bp与己糖激酶有高度的同源性,我们因此推测,该差异片段的功能应与己糖激酶具有一定的相似性。其具体功能还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 前言
• 1.1 人参的研究现状
• 1.2 诱导子的研究进展
• 1.3 水杨酸作为诱导子研究进展
• 1.4 三萜皂苷合成途径
• 1.5 植物基因差异表达（DGE）分析方法
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 水杨酸对人参培养物生理生化指标的影响
• 2.3 cDNA代表性差异分析（cDNA-RDA）
• 2.4 差异片段的克隆
• 2.5 测序
• 第三章 结果与分析
• 3.1 水杨酸添加对人参培养物中生理生化指标的影响
• 3.2 cDNA代表性差异分析
• 3.3 差异片段的克隆
• 3.4 酶切鉴定
• 3.5 测序及同源性比较
• 第四章 讨论
• 4.1 水杨酸对人参培养物生长周期及皂苷含量的影响:
• 4.2 cDNA-RDA技术的优越性
• 4.3 水杨酸调控的差异表达基因片段
• 第五章 结论
• 5.1 水杨酸对人参皂苷合成的影响
• 5.2 水杨酸对人参细胞培养周期的影响
• 5.3 水杨酸对过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶的影响
• 5.4 差异基因片段的克隆
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介