广西巴马小型猪Myostatin和Leptin基因的克隆、表达及动物免疫实验

论文摘要

肌肉生长抑制素（Myostatin）属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员之一,又名为生长/分化因子-8（GDF-8）。Myostatin是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白,其作用特征是对肌肉生长有负调控作用,myostatin基因自然突变导致其生物活性的改变可以引起肌肉重量的显著增加。瘦素蛋白（Leptin）是由脂肪组织合成的一种重要肽类激素。通过与细胞膜上的长型受体结合,leptin启动了胞内一系列的信号转导系统,将身体能量贮存水平信号传送至大脑,从而对能量摄入与消耗进行调节。参照GenBank发表的猪myostatin和leptin基因序列,分别设计两对特异性引物,以广西巴马小型猪肌肉组织和脂肪组织的总RNA为模板,通过反向聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出相应的cDNA片段。扩增片段纯化后,连接到pMD18-T载体,转入DH5α细菌扩增并测序。结果表明:扩增的myostatin基因序列为1128bp,leptin成熟肽基因序列为441bp,包含了各自成熟肽序列。同源性比较显示,广西巴马小型猪myostatin和leptin基因与GenBank报道的猪的相应基因序列的同源性分别达到99.7%和99.1%。将克隆得到的myostatin和leptin基因序列,分别加入BamHI和EcoRI、BamHI和HindⅢ酶切位点,定向连接到原核表达载体pRSETA质粒上,构建pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin融合表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）LysS。经SDS-PAGE和western Blotting分析,本研究成功地表达了myostatin和leptin的融合蛋白。表达蛋白经1 mmol/L IPTG诱导7h（myostatin）或4h（leptin）表达量达到最高,并以包涵体的形式存在。将pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin重组菌进行大量表达后,包涵体用6mol/L的盐酸胍变性,可溶部分在50%Ni-NTA树脂上过柱纯化,通过透析使蛋白质复性,得到较纯的MSNT75和leptin融合蛋白。利用纯化得到的融合蛋白制备了MSNT75和leptin融合蛋白油乳剂疫苗。本研究应用广西巴马小型猪myostatin成熟肽重组融合蛋白疫苗主动免疫小鼠、广西巴马小型猪和鸡后,实验组和对照组相比,其平均体重和平均增重都有下降的趋势,但差异不显著（P＞0.05）,体内并未检测到相应的抗体。用广西巴马小型猪leptin成熟肽重组融合蛋白疫苗主动免疫小鼠后,小鼠的体重没有显著变化（P＞0.05）,但实验组采食量显著低于对照组（P＜0.05）。综上所述,本研究克隆了myostatin和leptin基因,成功表达了其成熟肽融合蛋白,制作了融合蛋白油乳剂疫苗,进行初步的动物免疫实验,所获得的结果为进一步研究myostatin和leptin基因的生物学功能及为myostatin和leptin基因在生产实践上的应用奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 第一节 肌肉生长抑制素（Myostatin）研究进展
• 1.Myostaitn的发现和基因表达
• 2.Myostatin基因的结构
• 3.Myostatin基因的保守性及其部分突变点
• 4.Myostaitn基因的生物学作用及机制
• 5.Myostaitn基因在畜牧业上的应用
• 第二节 肥胖基因（Letpin）研究进展
• 1.Leptin基因的发现及研究现状
• 2.Leptin基因的结构及分布
• 3.Leptin基因的生物学作用及机制
• 4.Leptin基因在畜牧业上的应用
• 第三节 本研究的目的和意义
• 第二章 实验研究
• 材料
• 主要仪器
• 溶液与培养基的配制
• 实验一 广西巴马小型猪肌肉生长抑制素（Myostaitn）cDNA的克隆和肥胖基因（Letpin）成熟肽序列的cDNA克隆
• 1.实验方法
• 2.结果与分析
• 3.讨论
• 实验二 广西巴马小型猪myostatin和leptin基因融合蛋白的表达
• 1.实验方法
• 2.结果与分析
• 3.讨论
• 实验三 广西巴马小型猪myostatin和leptin基因融合蛋白纯化及动物免疫实验
• 1.实验方法
• 2.结果与分析
• 3.动物实验
• 4.讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 常用缩写词
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况