论文摘要
植物悬浮培养细胞系，包括目前构建最好的烟草和拟南芥细胞系，主要由10多个细胞构成的小细胞团组成。建立单细胞悬浮系是植物细胞培养的理想目标。单细胞悬浮系可以经常性地提供遗传背景和生理状态一致的单细胞群体，在进行细胞生物学研究、突变细胞株筛选、大规模细胞培养、基因功能分析和遗传工程等方面具有重要应用价值，但难以获得。由于果胶是植物细胞悬浮培养中引起相邻细胞相互粘连的主要介质，因此，如果有效地抑制植物离体培养细胞的果胶合成，就有可能开辟一条建立植物单细胞悬浮系的新途径。果胶是由糖类物质组成的高分子聚合物，主要存在于植物细胞间层和初生壁中，其中，胞间层的果胶质使相邻的细胞彼此粘连。研究发现，半乳糖醛酸（GalA）占了植物细胞原生壁中糖残基的20％-35％，是果胶多糖的重要组成成分。因此，参与GalA活化过程的酶应该在调控果胶生物合成中起重要作用。许多研究结果表明，UDP-葡糖醛酸差向异构酶（UDP-GlcA4-epimerase，即UGlcAE）是催化UDP-葡萄糖醛酸（UDP-α-D-glucuronic acid，即UDP-GlcA）向UDP-半乳糖醛酸（UDP-α-D-galacturonic acid，即UDP-GalA）转化的关键酶。AtUCAE基因家族有6个成员，如果选择该家族基因的保守序列构建成反义基因，就有可能抑制该家族基因的表达，达到阻止植物细胞果胶合成和细胞粘连的目的。本论文自拟南芥AtUGAE4基因（At2g45310）克隆了家族保守序列，构建成反义基因表达载体，并通过“冻融法”导入农杆菌。经农杆菌介导，分别对番茄、拟南芥和烟草进行了转化，获得了20多株烟草再生植株和大量的番茄与拟南芥的愈伤组织，以期构建的AtUGAE4反义基因在转基因植物中表达，产生与该基因的转录产物互补的反义mRNA片段，从而抑制该基因及其整个家族基因的表达。主要研究结果包括以下几个方面：1．拟南芥根悬浮培养体系的建立本实验需要大量采用拟南芥的根作为材料。将拟南芥种子消毒后在无菌操作台内播种于1／2MS固体培养基中发芽。播种20d后剪取幼根，分别转入附加0 mg／L、0.05 mg／L、0.1 mg／L和0.2 mg／LNAA的MS液体培养基中摇瓶培养。结果表明，适合根生长的最适NAA浓度为0.05mg／L，在此浓度下，根的数量和长度的数值都比在其它浓度下高。2．AtUGAE4基因的家族保守序列的克隆、序列测定及反义表达载体的构建提取拟南芥基因组总DNA，高保真pfuDNA聚合酶扩增目的片段。回收PCR产物，连接到pMD18-T载体上，送上海生工测序。测序结果表明所得AtUGAE4片段与公布的序列有一个碱基不同。获得的载体通过XbaⅠ／SacⅠ双酶切，回收AtUGAE4基因片段，并与XbaⅠ／SacⅠ双酶切的pSAU2008质粒大片段相连接，得到含有35S-reAtUGAE-Tnos反义基因表达盒的表达载体pB+35SrUGAE4。该反义基因表达载体经PCR、酶切鉴定正确无误后导入农杆菌EHA105，用于遗传转化。3．AtUGAE4反义基因转化番茄和拟南芥将获得的AtUGAE4反义基因分别转化番茄和拟南芥。对转化外植体分化的愈伤组织在10×16倍显微镜下观察边沿愈伤组织的聚集情况。结果显示，转化外植体分化的愈伤组织比较紧密，与未转化外植体分化的愈伤组织无明显区别，AtUGAE4反义基因在番茄和拟南芥中对果胶合成的抑制不明显。4．AtUGAE4反义基因在烟草中的功能验证采用农杆菌介导的叶盘转化法将AtUGAE4反义基因导入烟草中。对转化植株目的反义基因AtUGAE4进行PCR检测，电泳结果显示，出现预期的700bp左右的AtUGAE4基因的目标条带；而非转化植株呈阴性，证明外源基因已整合到烟草植株的基因组中。结果表明，AtUGAE反义基因在烟草中对果胶合成没有明显抑制作用，细胞间的粘连性没有受到明显的影响。