油菜病毒株系鉴定和抗病相关基因研究及转基因飘逸评价

论文摘要

病毒病是影响油菜生产的主要病害,病害流行年份可造成严重的经济损失。油菜病毒有明显的株系分化,株系间存在致病性差异;目前缺乏对病毒病高抗或免疫的油菜品种,病毒病抗病分子机制研究相对滞后,尚未找到关键抗病相关基因。因此开展油菜功能基因组学研究,探明油菜抗病分子机制,获得关键的功能基因,培育转基因抗病毒新品种,是从根本上解决该病害防治问题的有效途径。另一方面,有关转基因油菜中外源基因飘逸至邻近非转基因植株、近缘杂草或近缘野生种所带来的潜在风险,目前仍是人们最为关注的问题。转基因油菜在我国虽然没有商业化种植,但许多单位正在积极研究开发,而且我国每年都从国外进口大量转基因油菜籽,所以转基因的飘逸与环境安全性评估必不可少,但我国却极少有相关的研究报道。本研究在田间病害调查的基础上,鉴定了13个油菜品种和14份油菜种质资源材料对主要病毒TuMV的抗性,通过分析病毒分离物对油菜品种的致病力差异,进而明确我国油菜主要病毒株系的变异情况。从本课题组构建的油菜抗病性相关UniGene库中挑选3个抗病相关基因,进行转基因表达研究,以明确这些基因的功能与抗病育种利用价值。研究了在我国自然环境条件下由花粉介导的转基因飘逸距离及其影响因素,为我国转基因油菜的商品化生产和安全管理提供科学依据。取得的主要研究结果如下:1.明确了油菜病毒病的主要毒源及相关分离物的分类归属。从湖北和安徽两省12个县市采集258份油菜病毒病害样品,ELISA检测结果表明:芜菁花叶病毒（Turnipmosaic virus,TuMV）占病害样品总量的90.7%,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）占8.9%,油菜花叶病毒（Youcai mosaic virus,YoMV）占0.8%。在人工高病害压接种条件下,对当前生产上应用的13个油菜品种及14份资源材料进行TuMV抗性鉴定的结果表明,参试的13个油菜品种均不抗TuMV,但感病性低于对照品种中油821;14份油菜资源材料间抗性差异显著,有3份材料表现高抗和中抗。TuMV分离物对油菜品种的致病力测定表明,TuMV分离物致病力无明显的地域性差异,各地都存在致病力强弱不同的毒株。测序获得了18个TuMV分离物的CP基因序列,序列同源性比较及遗传进化树分析表明,其中17个分离物与MB类群代表分离物序列同源性在97%以上,均属于MB类群;萝卜分离物WRS1与MR类群代表分离物同源性在95.4%～98.7%之间,归属于MR类群;另外一个萝卜分离物WRS2在MB类群中单独形成一个分支,可能是2个类群发生重组的后代。2.明确了油菜上一种杆状病毒分离物属YoMV的一个株系。在我国,侵染油菜的一种烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的杆状病毒长期以来被认为是烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）。本研究对一个油菜的杆状病毒分离物进行生物学、血清学及分子生物学特性分析,发现该病毒对十字花科作物致病力强,对茄科作物致病力弱,寄主范围与TMV不同;提纯病毒粒体呈短杆状,平均大小约为295nm×15nm,与TMV极为相似;该病毒与TMV在血清学性质上存在明显差异,亲缘关系较远;对病毒3’末端2283bp序列分析发现,该病毒mp、cp和3’末端非编码区（NCR）大小分别为798bp、474bp和235bp,mp和cp基因之间有77bp重叠序列。序列同源性比较和遗传进化树分析表明,该病毒与TMV同源性低于60%,与Tobamovirus属中侵染十字花科病毒的同源性高于80%,其中与YoMV不同株系的同源性高于90%,因而将该分离物划分为YoMV的一个株系。由于从武汉分离,故命名为YoMV武汉株系（YoMV-Wh）,该研究为准确划分我国Tobamovirus属油菜杆状病毒的归属提供了依据。3.构建了3个抗病相关基因的植物过表达载体及RNAi载体,转化油菜并获得抗病毒的转基因植株。从本课题组构建的油菜抗病性相关UniGene库中挑选与主要抗病反应途径相关的3个基因BN1、BN5和BN10,并用5’-RACE法克隆出非全长基因的全序列,分别构建了各基因的植物过表达载体和RNAi载体,通过花粉管通道法在授粉后8～12h将表达载体导入甘蓝型油菜。经过除草剂筛选、PCR检测及Southern blot鉴定,确认获得3个基因的4株转基因油菜,后代突变性状观察发现一株黄白花雄性不育突变体和一株黄白双色花嵌合体。BN5基因RNAi载体T1代转基因株系目标基因荧光定量PCR分析表明:转基因植株中BN5基因的表达受到抑制,但不同单株受抑制的程度不同,表达量最低的单株相对表达量仅为非转基因对照的20%。多数转基因阳性植株接种病毒后比非转基因对照更为感病,且对CMV的感病程度要高于YoMV和TuMV。由此可见,BN5基因具有天然的抗病毒功能,有重要的抗病育种利用价值。4.首次报道了在我国环境条件下转基因油菜花粉介导的基因飘逸距离及频率。利用除草剂抗性基因bar作为标记基因检测花粉飘逸。研究结果表明:花粉飘逸的距离达2000m,且飘逸率随着与花粉源区距离的增加而急剧减少。但在距花粉源区33.5m到2000m的范围内,花粉飘逸率均低于0.015%,并不随距离增加而逐渐下降,表现了花粉长距离飘逸和授粉的随机性。绝大多数花粉散布在花粉源区周围4.5m范围内,其中最大飘逸率为1.19%,出现在距源区1.4m的取样点。风向显著影响花粉飘逸的方向和距离。授粉昆虫蜜蜂的数量与花粉飘逸方向和距离没有相关性,表明花粉飘逸的方向性差异并不是由于蜜蜂的数量及分布引起的。本项花粉介导的基因飘逸距离和频率的研究属国内首次报道。花粉空间分布模型为油菜杂交种生产的隔离距离与杂种纯度估计等研究提供了重要的理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 油菜病毒病的危害及病毒的生物学特性
• 1.1 油菜病毒病的危害
• 1.2 油菜三种主要病毒的生物学特性
• 1.3 油菜三种主要病毒的分子生物学特性
• 1.3.1 基因组结构
• 1.3.2 遗传变异及株系划分
• 1.3.2.1 TuMV
• 1.3.2.2 CMV
• 1.3.2.3 TMV
• 1.4 植物病毒的防治策略
• 2 植物抗病的分子机制
• 3 植物对病毒病抗性机制
• 3.1 植物对病毒的自然抗性
• 3.2 病原诱导抗病性
• 3.3 病毒诱导基因沉默
• 3.3.1 RNA介导的抗病毒机制
• 3.3.2 转录后基因沉默机制
• 4 植物对三种病毒的抗性研究现状
• 4.1 植物对TuMV的抗性研究
• 4.2 植物对CMV的抗性研究
• 4.3 植物对TMV的抗性研究
• 5 抗病基因功能研究技术
• 5.1 表达谱技术
• 5.2 转基因沉默技术
• 5.2.1 转基因沉默
• 5.2.2 RNA沉默载体
• 6 油菜的遗传转化方法
• 6.1 组织培养的遗传转化法
• 6.2 非组织培养的遗传转化法
• 7 转基因油菜环境安全性分析
• 7.1 转基因油菜可能存在的环境风险
• 7.2 转基因飘逸风险分析
• 7.2.1 油菜开花生物学特性
• 7.2.2 影响异交率的因素
• 7.2.3 种子与基因扩散
• 7.2.4 基因向近缘种扩散的可能性
• 7.3 生态风险的监控与防范措施
• 8 本研究的目的与内容
• 第二章 油菜病毒种类血清学检测及油菜品种对芜菁花叶病毒的抗性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 病害样品
• 1.1.2 油菜品种
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 病害调查和样品采集
• 1.2.2 间接ELISA法鉴定病毒种类
• 1.2.3 毒源保存及复活
• 1.2.4 人工接种鉴定方法
• 1.2.5 病害调查
• 1.2.6 数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒病发生情况调查结果
• 2.2 病害样品血清学检测结果
• 2.3 病害症状与油菜类型及病毒种类的关系
• 2.4 油菜品种对TuMV的抗性鉴定结果
• 2.5 油菜资源材料对TuMV的抗性鉴定结果
• 3 讨论
• 第三章 芜菁花叶病毒致病力差异及壳蛋白基因序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒源
• 1.1.2 油菜品种
• 1.2 方法
• 1.2.1 毒源的保存及复活
• 1.2.2 供试油菜的栽培
• 1.2.3 接种鉴定方法
• 1.2.4 病害调查及数据分析
• 1.2.5 TuMV分离物总RNA的提取
• 1.2.6 引物设计
• 1.2.7 RT-PCR扩增病毒CP基因
• 1.2.8 电泳检测及测序
• 1.2.9 序列分析
• 1.2.10 主要试剂
• 2 结果与分析
• 2.1 TuMV分离物对油菜品种致病力差异分析
• 2.2 TuMV株系核酸遗传变异分析
• 2.2.1 TuMV CP基因RT-PCR产物电泳分析
• 2.2.2 TuMV CP基因序列同源性比较
• 2.2.3 TuMV CP核苷酸序列同源性遗传进化树分析
• 3 讨论
• 第四章 油菜花叶病毒WH株系的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒源
• 1.1.2 抗血清
• 1.1.3 植物材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 病毒寄主范围测定
• 1.2.2 病毒提纯
• 1.2.3 提纯病毒的紫外吸收测定
• 1.2.4 病毒粒体电镜观察
• 1.2.5 提纯病毒与普通TMV血清学关系比较
• 1.2.6 病毒dsRNA的提取
• 1.2.7 引物设计
• 1.2.8 RT-PCR扩增及电泳检测
• 1.2.9 核苷酸和氨基酸序列同源性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 寄主范围测定
• 2.2 提纯病毒紫外吸收特征及浓度
• 2.3 提纯病毒粒子的形态观察
• 2.4 YoMV-Wh与TMV血清学亲缘关系比较
• 2.5 YoMV-Wh 3'末端核苷酸2283 bp cDNA片段序列分析
• 2.5.1 RT-PCR扩增结果
• 2.5.2 YoMV-Wh 3'末端核酸2283 bp cDNA片段序列和结构分析
• 2.5.3 YoMV-Wh与同属其他病毒序列同源性比较
• 2.5.4 YoMV-Wh与同属其他病毒遗传进化树分析
• 3 讨论
• 第五章 油菜抗病毒相关基因转化甘蓝型油菜
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 质粒
• 1.1.4 本研究所构建的质粒
• 1.1.5 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 目的基因的挑选
• 1.2.2 RNA的提取
• 1.2.2.1 RNA提取方法
• 1.2.2.2 DNA的消化
• 1.2.2.3 RNA浓度测定
• 1.2.2.4 反转录
• 1.2.3 5'-RACE克隆非全长目的基因的全序列
• 1.2.3.1 非全长基因特异性引物设计
• 1.2.3.2 第一链cDNA的合成
• 1.2.3.3 用S.N.A.P.柱子提纯cDNA
• 1.2.3.4 cDNA TdT加尾
• 1.2.3.5 用dC-tailed cDNA作模板进行PCR
• 1.2.3.6 巢式扩增
• 1.2.4 质粒DNA小量提取
• 1.2.5 DNA的限制性酶切
• 1.2.6 目的基因的PCR扩增
• 1.2.7 PCR清洁试剂盒回收DNA
• 1.2.8 从凝胶中回收目的DNA
• 1.2.9 DNA片段与载体连接
• 1.2.10 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.11 质粒DNA转化大肠杆菌
• 1.2.12 重组质粒DNA的大量提取及浓度确定
• 1.2.13 花粉管通道法转化甘蓝型油菜
• 1.2.13.1 转化时间的确定
• 1.2.13.2 花粉管通道法转化步骤
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因的确定
• 2.2 RNA质量检测
• 2.3 基因全长序列的获得
• 2.3.1 非全长基因BN5 5'-RACE特异性引物的设计
• 2.3.2 GSP引物特异性扩增结果
• 2.3.3 3个目的基因序列分析
• 2.4 植物过表达载体构建
• 2.4.1 中间载体pG4A的构建及酶切鉴定
• 2.4.2 目的基因植物过表达载体构建
• 2.4.2.1 BN1基因植物过表达载体构建
• 2.4.2.2 BN5基因植物过表达载体构建
• 2.4.2.2.1 BN5基因5'端880bp片段PCR扩增
• 2.4.2.2.2 BN5基因3'端1182 bp片段PCR扩增
• 2.4.2.2.3 BN5基因过表达载体构建及酶切鉴定
• 2.4.2.3 BN10基因植物过表达载体构建
• 2.5 植物RNAi载体构建
• 2.5.1 pRNAi-BN1载体的构建
• 2.5.2 pRNAi-BN5载体的构建
• 2.5.3 pRNAi-BN10载体的构建
• 2.6 油菜子房授粉后花粉管伸长状况观察
• 2.7 甘蓝型油菜遗传转化
• 2.7.1 大量提取的质粒DNA浓度确定
• 2.7.2 甘蓝型油菜遗传转化
• 3 讨论
• 第六章 转基因油菜的分子检测及对病毒的抗性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 除草剂
• 1.1.3 毒源
• 1.1.4 主要生物学试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 TO代转基因油菜幼苗培养
• 1.2.2 除草剂筛选
• 1.2.3 幼苗移栽
• 1.2.4 转基因油菜基因组DNA提取
• 1.2.5 RNA的提取
• 1.2.6 转基因油菜PCR检测
• 1.2.7 转基因油菜Southern blot检测
• 1.2.7.1 基因组DNA的限制性内切酶酶解
• 1.2.7.2 DNA酶解片段的电泳分离
• 1.2.7.3 探针标记
• 1.2.7.4 DNA转移与固定
• 1.2.7.5 Southern杂交
• 1.2.7.6 免疫检测
• 1.2.8 转基因油菜T1代株系bar基因分离比例调查
• 1.2.9 荧光定量PCR检测T1代转基因株系目的基因的相对表达量
• 1.2.9.1 反应条件
• 1.2.9.2 数据处理方法
• 1.2.10 转基因油菜T1代株系病毒接种鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 T0代转基因油菜的筛选及PCR鉴定
• 2.2 转基因油菜Southern blot鉴定
• 2.2.1 油菜基因组DNA浓度检测
• 2.2.2 Southern blot鉴定
• 2.3 转基因油菜性状变异观察
• 2.3.1 转基因油菜T0代株系变异观察
• 2.3.2 转基因油菜T1代株系变异观察
• 2.4 转基因油菜T1代株系bar基因分离状况调查
• 2.5 转基因油菜T1代株系目的基因荧光定量PCR分析
• 2.5.1 PCR条件优化和特异产物扩增
• 2.5.2 目的基因在转基因植株中的相对表达水平
• 2.6 转基因油菜T1代株系对病毒的抗性鉴定
• 3 讨论
• 第七章 转基因油菜基因飘逸分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 除草剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实验场地及装备
• 1.2.2 实验设计
• 1.2.3 调查方法
• 1.2.4 抗性植株的筛选及鉴定
• 1.2.5 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 非转基因植株后代中bar基因的PCR检测
• 2.2 飘逸率在品种、距离和方向间的变异分析
• 2.3 花粉飘逸的距离差异
• 2.4 花粉飘逸的方向差异
• 2.5 花粉飘逸在品种间的差异
• 2.6 影响花粉飘逸的因素分析
• 2.6.1 风对花粉飘逸的影响
• 2.6.2 花期蜜蜂的数量对花粉分布的影响
• 2.7 花粉空间分布
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录1 主要试剂及溶液的配制
• 附录2 目的基因序列
• 附录3 基础载体图谱
• 附录4 在读期间论文发表情况
• 致谢