论文摘要
动脉粥样硬化性心血管疾病被称为发达国家的“头号杀手”,在发展中国家发病率也越来越高。世界卫生组织预测,在世界范围内的传染性疾病病死率得到有效控制之后,到2020年心血管疾病将成为世界第一死因[1]。动脉粥样硬化性心血管疾病是严重危害人类健康的一大类疾病,致死、致残率高,对该病的预防诊治研究一直是各国政府的投入重点。目前存在的主要问题是识别不稳定斑块并及早临床干预,增强斑块的稳定性。基因治疗是稳定粥样斑块很有前途的治疗方法,我们通过过度表达高密度脂蛋白（High density lipoproteins,HDL）受体基因,使血浆HDL水平显著升高,从而影响动脉粥样硬化的发生和进程,减少诱发斑块破裂的外部因素。基因治疗的关键和基础是将治疗基因精确的输送到靶器官/细胞内。本试验旨在将超微超顺磁性氧化铁（ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO）作为磁性纳米载药系统输送治疗基因,利用纳米载药系统的特性和外加磁场的导向作用,为动脉粥样硬化斑块基因治疗寻求一种转移效率更高、不良反应更少、应用更简便的治疗方法。方法1.基因扩增从Genebank中获得大鼠Apo-A-I（apolipoprote class A type I,载脂蛋白A族I型）和SR-BI（scavenger receptor class B type I,B族I型清道夫受体）的pcDNA序列,根据实验需要设计引物。Wistar大鼠肝组织经匀浆、分离、沉淀、溶解、抽提Apo-A-I、SR-BI mRNA。根据TAKARA One–step RT-PCR方法,用引物扩增出Apo-A-I基因和SR-BI重组基因。将PCR产物与pGEM-T载体连接转化到大肠杆菌TG1中,筛选阳性克隆,双酶切中间克隆载体pGEM-T/Apo-A-I和pGEM-T/SR-BI和表达载体pcDNA3.1（+）,将Apo-A-I和SR-BI基因插入到表达载体pcDNA3.1（+）中,获得重组表达载体pcDNA3.1（+）/SR-BI和pcDNA3.1（+）/Apo-A-I,酶切鉴定后,用真核表达质粒子瞬时转染大鼠肝细胞株,观察基因的表达。2.脂质体的制备用逆相蒸发法制备带正电荷的磁性脂质体,再将该脂质体与DNA通过静电作用形成复合物;电镜观察其形态并对单个脂质体进行能谱分析;Zetasize激光衍射粒度分析仪测其粒径分布及平均粒径;冷冻高速离心后测紫外吸收来测定DNA包封率;观察复合物的体外磁场响应性。3.动脉粥样硬化动物模型的建立雄性Wistar大鼠50只,体重（210±10）g,对照组4只喂食基础饲料,实验组46只喂食高脂饲料,即3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、8%猪油、83.3%基础饲料。两组动物每日每只喂养饲料20g,均自由摄水,实验组同时在喂食开始时一次性腹腔注射维生素D60万IU/kg,对照组给予同等体积的生理盐水。对照组、实验组均于开始喂养时、3周、6周测血脂四项,于6周各处死4只动物,分离取出腹主动脉,部分主动脉做大体标本,部分做横断面病理切片,并采用不同病理染色以明确斑块内不同成份。大体病理标本经油红O染色后,用投影格子计数法分别计算:每条主动脉内膜总面积、胸腹主动脉内膜面积、油红O染色阳性的斑块面积,求出斑块面积白分比。分别清点有斑块的切片数和无斑块的切片数,并采用χ2分析,采用SPSS11.5英文版软件处理分析。对横断面病理切片分析斑块的成份、管腔的狭窄程度。4.基因治疗将建成动脉粥样斑块模型的42只动物,按照完全随机的方法分组进行基因治疗。共分四组,第一组:A组,12只,给予含Apo-A-I基因的磁性脂质体/DNA复合物;第二组:B组,12只,给予含SR-BI基因的磁性脂质体/DNA复合物;第三组:C组,12只,给予含上述两种基因的磁性脂质体/DNA复合物;第四组:D组,6只,做为空白对照,给予不含基因的磁性脂质体复合物。每只剂量0.32m（l相当于40ug基因）,将大鼠麻醉,固定在平板上,经尾静脉给药后,在其左侧肾脏附近绑缚铷铁硼稀土磁铁（场强500mmT）进行磁诱导,约4小时后将磁铁取下。基因治疗后3周、6周测血脂四项,并于3周、6周各处死6只动物,分离取出腹主动脉,做大体标本及横断面病理切片,病理及统计方法同前。结果1.基因扩增应用TRIZOL试剂抽取肝组织的RNA,可见有明显的3条带,分别为28S、18S、5S。经紫外分光光度计检测,OD260/280B为1.85,表明获得了质量较好的RNA模板。中间克隆载体pGEM-T/ Apo-A-I和pGEM-T/SR-BI经双酶切鉴定,目的基因大小为780bp与1602bp左右,与预计值相符。经联合基因测序,与预期的序列相一致。重组表达载体pcDNA3.1（+）/SR-BI和pcDNA3.1（+）/Apo-A-I双酶切鉴定,片段大小与预期相符,表明获得了较好的重组表达载体。流式细胞术及Western Blotting方法检测表明SR-BI、Apo-A-I能在Wistar大鼠肝细胞中正确的获得表达。2.脂质体的制备用逆相蒸发法制备得到的磁性脂质体粒径分布在50-200nm,磁性脂质体/DNA复合物的粒径分布在200-400nm,并且单个脂质体中含有硅和锰、锌、铁等成份;当DNA与脂质体电荷比为1∶7时具最高包封率81.4%;体外磁场响应性实验显示磁性脂质体/DNA复合物具有良好的磁场响应性。3.动脉粥样硬化动物模型的建立高脂喂养后,分别于开始时、3周、6周经大鼠眼眶静脉采血,测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）,获得生化数据经统计学处理（P<0.01）,表明高脂喂养延长,血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）明显升高,高密度脂蛋白（HDL）明显下降。对照组动脉主动脉柔软有弹性,管腔内膜光滑。实验组动物均出现动脉粥样硬化斑块,血管管壁明显僵硬增厚,并可见白色条纹状隆起。经油红O染色的大体病理显示:血管内膜表面多发不规则的红色隆起,镜下显示内皮细胞增生明显,纤维膜下可见大量泡沫细胞聚集,斑块突向管腔,呈典型的斑块表现。4.基因治疗各基因治疗组动脉粥样硬化斑块减小,部分血管管壁变柔软,弹性恢复,管腔内膜变光滑,血管管壁增厚不明显。经油红O染色的大体病理显示:血管内膜表面不规则的红色隆起减少,基因治疗A1组脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为9.17%和1.11%,A2组分别为9.19%和1.17%,B1组分别为9.23%和1.13%、B2组分别为9.20%和1.18%,C1组分别为9.21%和1.13%,C2组分别为9.22%和1.16%。镜下显示内皮细胞增生减弱,纤维膜下可见少量泡沫细胞聚集。对照组血管管壁仍明显僵硬增厚,血管内膜表面多发不规则的红色隆起,脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为32.25%和1.66%。镜下显示内皮细胞增生明显,纤维膜下可见大量泡沫细胞聚集,斑块突向管腔,呈典型的脆性斑块表现。基因治疗3周、6周各基因治疗组与对照组斑块率的比较,P<0.01,差异有统计学意义,说明基因治疗均有效。进一步分析发现,3周时各基因治疗组间进行斑块率的比较以及6周时各基因治疗组间进行斑块率的比较,均有P>0.05,无显著差异,说明3周时以及6周时各组基因治疗作用相当。另外,各基因治疗组基因治疗3周与基因治疗6周斑块率的比较,均有P>0.05,差异无显著性,提示在一定时间内基因治疗可以持续发挥作用。结论本系列研究结果证实:（1）超微超顺磁性氧化铁（USPIO）作为磁性纳米载药系统输送治疗基因有效可行。（2）SR-BI、Apo-A-I基因在外加磁场导入下,可以定向到达肝脏,提高HDL的生物效应,加速斑块内炎症、MMPS密切相关的LDL清除,从而提高斑块的稳定性,发挥基因治疗作用。