黄瓜（Cucumis sativus L.）酸性α-半乳糖苷酶的离体表达与酶学性质研究

论文摘要

黄瓜（Cucumis sativus L.）以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,而α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）是催化黄瓜体内水苏糖分解的关键酶。为研究黄瓜体内水苏糖卸出的分子机制,本实验室前期克隆了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的cDNA全长序列。为验证这2个基因克隆的正确性,研究它们的酶学性质,指导后续的分离纯化实验,探索它们在黄瓜水苏糖代谢中的生理功能,本实验采用昆虫杆状病毒表达载体系统离体表达了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因。为此,本实验设计了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的特异引物,运用聚合酶链式反应（PCR）技术,扩增其编码区序列,经连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选重组子,构建杆状病毒表达载体。利用野生型杆状病毒和表达载体共转染健康的昆虫细胞系Sf9,生产重组病毒,离体表达了2个待验证基因。经检测表明2个基因在昆虫细胞中的表达产物均具有酸性α-半乳糖苷酶活性,证明这2个基因确实为酸性α-半乳糖苷酶基因。进一步研究了离体表达的2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对人工底物pNPG的最佳反应pH值、最适反应温度、米氏常数（Km）、最大反应速度（Vm）、D-半乳糖对活性的抑制效应以及对水苏糖、棉籽糖的催化活性。结果表明:黄瓜α-半乳糖苷酶Ⅰ对pNPG的最佳反应pH值为4.8,最适反应温度为30℃,对pNPG的Km为8.99×10-4mol/L,Vm为3.34×10-2mol/L·min;黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅱ对pNPG的最佳反应pH值为6.1,最适反应温度为35-40℃,对pNPG的Km为1.35×10-3mol/L,Vm为3.36 mol/L·min。低浓度的D-半乳糖对2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶活性均具有显著的抑制作用。2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对棉籽糖均具有较高的亲和性,对水苏糖的亲和性相对较低。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 文献综述
• 第一部分 高等植物中α-半乳糖苷酶的不同形式及其酶学性质
• 1.1 高等植物中α-半乳糖苷酶与水苏糖卸出的关系
• 1.2 α-半乳糖苷酶在高等植物中的不同形式和分布
• 1.3 α-半乳糖苷酶在高等植物中的酶学性质
• 1.4 研究展望
• 第二部分 昆虫杆状病毒表达载体系统及其应用研究进展
• 2 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶昆虫杆状病毒表达载体的构建
• 2.1 材料、试剂与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂、载体
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 黄瓜幼叶总RNA 的提取
• 2.2.2 RT-PCR反应扩增2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶编码区
• 2.2.3 巢式PCR 验证回收的目的片段
• 2.2.4 重组质粒的酶切验证分析
• 2.2.5 重组质粒的PCR 验证分析
• 2.2.6 序列测定结果与分析
• 3 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶的离体表达
• 3.1 试剂和技术路线
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 技术路线
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 昆虫Sf9 细胞系培养
• 3.2.2 表达载体的准备
• 3.2.3 重组质粒的提取
• 3.2.4 共转染
• 3.2.5 扩增病毒产生高滴度病毒储液
• 3.2.6 接种病毒，表达重组蛋白
• 3.2.7 目的蛋白的收获
• 3.2.8 目的蛋白的活性检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 昆虫sf9 细胞系培养
• 3.3.2 表达载体的准备
• 3.3.3 共转染
• 3.3.4 目的蛋白的表达及活性检测
• 4 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶的酶学性质研究
• 4.1 试剂和方法
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 最佳 pH 的确定
• 4.2.2 最适反应温度的确定
• 4.2.3 Km 值和Vm 值的测定
• 4.2.4 D-半乳糖的抑制作用
• 4.2.5 对棉籽糖和水苏糖的催化活性
• 5 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表或待发表的学术论文目录