黑木耳核糖体失活蛋白基因的克隆

论文摘要

核糖体失活蛋白（RIP）是一类广泛存在于植物界中的毒蛋白。由于其对人类和动物细胞具有独特的生物活性和对治疗艾滋病、癌症等具有潜在的应用价值,从而引起了人们极大的兴趣。目前报道的RIP大多来自高等植物,在食用菌中也有一些发现。本文针对黑木耳中的RIP进行了研究。本项目研究是先从黑木耳菌丝体中分离得到RIP,测得其分子量为26KDa,再根据其氨基酸序列对RIP的基因进行克隆。首先,对纯化得到的RIP进行随机肽段的氨基酸序列测序。根据测序结果,结合黑木耳密码子的偏爱性及引物设计原则,设计简并引物。使用cDNA 3′-末端全长序列扩增试剂盒,进行3′-RACE反应。经过电泳、片段回收、连接、转化、蓝白筛选、质粒提取、PCR鉴定等操作,进行RIP cDNA 3′-端序列测定。根据测序结果,对序列进行分析,并设计特异性PCR巢式引物。使用cDNA 5′-末端全长序列扩增试剂盒,进行5′-RACE反应。再经过电泳、片段回收、连接、转化、蓝白筛选、质粒提取、PCR鉴定等操作,进行RIP cDNA 5′-端序列测定。最后,拼接3′-端和5′-端基因序列,得到完整的黑木耳RIP cDNA序列。整个cDNA全长序列为760bp,编码234个氨基酸序列,与其它RIP的同源性较小。本项目研究不但运用了一种克隆基因的有效方法,而且为下一步核糖体失活蛋白基因的外表达等研究工作做了良好的前期工作。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 RIP 的研究概况
• 1.1.1 RIP 的定义和研究历史
• 1.1.2 RIP 的分类和分布
• 1.1.3 RIP 的结构与功能
• 1.1.4 RIP 的酶学性质
• 1.2 RIP 的应用
• 1.2.1 抗生育活性
• 1.2.2 抗艾滋病病毒活性
• 1.2.3 抗肿瘤作用
• 1.2.4 植物的防御作用
• 1.2.5 调节细胞代谢的作用
• 1.2.6 作为储存蛋白
• 1.3 RIP 研究的意义
• 1.4 RIP 基因克隆的研究进展
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要生化试剂
• 2.1.4 主要缓冲液和试剂配置
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 主要实验器具
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RIP 的提取
• 2.2.2 RIP cDNA 3′-端的克隆
• 2.2.3 RIP cDNA 5′-端的克隆
• 2.2.4 RIP基因的cDNA全长序列及验证
• 第3章 结果与分析
• 3.1 黑木耳RIP 的提取
• 3.1.1 黑木耳菌丝体的培养
• 3.1.2 菌丝体RIP 的粗提
• 3.1.3 黑木耳RIP 的纯化
• 3.1.4 高压液相色谱测定RIP 的纯度
• 3.2 RIP cDNA 3′-端的克隆
• 3.2.1 RIP 的N-末端的氨基酸序列分析
• 3.2.2 RIP 的 MALDI-TOF 质谱分析
• 3.2.3 cDNA 3′-RACE 反应上游 PCR 引物的设计
• 3.2.4 菌丝体总RNA 的提取和纯度检测
• 3.2.5 RIP cDNA 的3′-RACE 反应
• 3.2.6 3′-RACE反应DNA片段的回收
• 3.2.7 克隆载体的构建及重组质粒的转化
• 3.2.8 阳性重组质粒的鉴定
• 3.2.9 3′-端基因片段的序列测定与分析
• 3.3 RIP cDNA 5′-端的克隆
• 3.3.1 菌丝体总RNA 的提取和纯度检测
• 3.3.2 5′-RACE反应下游特异性PCR引物的设计
• 3.3.3 RIP cDNA 的5′-RACE 反应
• 3.3.4 5′-RACE反应DNA片段的回收
• 3.3.5 克隆载体的构建及重组质粒的转化
• 3.3.6 阳性重组质粒的鉴定
• 3.3.7 cDNA 5′-端基因片段的序列测定
• 3.4 RIP基因的全长cDNA序列
• 第4章 讨论
• 4.1 黑木耳RIP 的提取
• 4.2 基因克隆过程中的蓝白筛选
• 4.3 基因克隆的3′-RACE 法
• 4.4 基因克隆的5′-RACE 法
• 4.5 PCR 条件的优化
• 4.6 关于后续工作
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文