论文题目: Bacillus sp.EL31410弹性蛋白酶发酵条件优化及分离纯化研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 食品科学
作者: 徐莹
导师: 何国庆
关键词: 弹性蛋白酶发酵条件,双水相萃取,纯化,稳定性
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶。可以由动物胰脏提取,也可以由微生物发酵法生产。弹性蛋白酶可以作为治疗高血脂症、防治动脉粥样硬化症等的生化药物;在食品工业中主要作为肉类嫩化剂,此外在动物蛋白水解、高级保健化妆品等方面均有应用。 本文以本实验室保藏的高产弹性蛋白酶菌株Bacillus sp.EL31410及其发酵的弹性蛋白酶为研究对象,采用优化的发酵培养基进行了5L发酵罐分批发酵工艺条件优化,并利用70L发酵罐完成了中试试验,从发酵液中纯化出弹性蛋白酶并研究其酶学性质,筛选并优化出提高弹性蛋白酶热稳定性的安全复合保护剂,估算了弹性蛋白酶的贮存寿命,对双水相体系纯化弹性蛋白酶也进行了研究,还探讨了菌源性弹性蛋白酶水解丝素蛋白的能力。主要结论如下: 1) 在5L发酵罐内应用好氧微生物培养技术进行分批发酵,研究其培养过程的特性,进行相应地动力学分析,建立了最适培养策略。温度对弹性蛋白酶分批发酵影响是明显的。37℃培养很适合该芽孢杆菌早期生长,当置于30℃培养时弹性蛋白酶酶活力最大。通过比较四种不同的温度培养模式后发现,30℃培养非常适合Bacillus sp.EL31410生产弹性蛋白酶。通过比较不同恒定pH进行Bacillus sp.EL31410分批发酵过程发现,pH对细胞的生长和弹性蛋白酶的合成影响很大。在恒pH 6.5和7.0时,细菌的生长情况都较好。恒定pH 7.0获得弹性蛋白酶活力值最高。提出了分段控制恒定pH策略,即0到24h恒定pH6.5,24h后恒定pH7.0,经验证,最大酶活力为699U/mL,48h达到产酶高峰。采用分段控制恒定pH策略,保持通气量不变,将搅拌转速由300rpm提高到400rpm,泡沫仍然能够控制,细胞的生长和产酶情况良好,并且在保持最大酶活力相当的情况下,发酵周期提前6h。 2) 根据5L发酵罐分批发酵的发酵工艺参数进行合理放大,调整后的70L发酵罐分批发酵参数为:培养温度30℃,通气量为1vvm,搅拌转速为230rpm,发酵过程中采用分段控制pH策略。发酵结果与5L罐发酵结果接近,在培养33h进入产酶高峰期,酶活力达到645U/ml。实现了成功地放大,为工业化生产奠定了基础。用Logistic方程、
论文目录:
目录
摘要
Abstract
第一章 文献综述
0 引言
1 弹性蛋白酶的分布
2 微生物源弹性蛋白酶的研究进展
2．1 弹性蛋白酶的微生物来源
2．2 发酵大豆液及豆制品中的微生物源弹性蛋白酶
2．3 细胞培养获得弹性蛋白酶
3 微生物源弹性蛋白酶的性质
3．1 弹性蛋白酶的理化性质
3．2 弹性蛋白酶的结构及特点
3．3 弹性蛋白酶降解弹性蛋白
3．3．1 弹性蛋白的性质和结构
3．3．2 弹性蛋白酶降解弹性蛋白机理研究进展
3．4 弹性蛋白酶降解其他蛋白的研究进展
3．4．1 弹性蛋白酶降解酪蛋白
3．4．2 弹性蛋白酶降解丝素蛋白
4 弹性蛋白酶的分子生物学研究进展
4．1 弹性蛋白酶基因的克隆和表达
4．2 蛋白质工程改造弹性蛋白酶
4．3 化学修饰弹性蛋白酶
5 弹性蛋白酶的功能与用途
5．1 在医药领域的应用
5．1．1 降低胆固醇、抑制粥样动脉硬化的作用
5．1．2 抑制脂肪肝的形成，增强肝中脂肪分解作用
5．1．3 预防和治疗糖尿病肾脏病的理想药物
5．2 在食品工业中的应用
5．2．1 肉类嫩化剂
5．2．2 在食品中的潜在应用
5．3 弹性蛋白酶在日用化工中应用
5．4 生物杀虫剂的辅助剂
6 选题背景及研究内容
第二章 弹性蛋白酶的发酵条件优化
0 引言
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．2 主要仪器
1．3 培养方法
1．3．1 种子培养
1．3．2 不同温度下发酵培养
1．3．3 5L发酵罐内不同pH分批发酵培养
1．3．4 5L发酵罐内不同搅拌转速分批发酵培养
1．4 分析方法
1．4．1 生物量
1．4．2 还原糖
1．4．3 pH
1．4．4 酶活力
2 结果和讨论
2．1 不同温度对弹性蛋白酶发酵的影响
2．1．1 不同温度对弹性蛋白酶摇瓶发酵的影响
2．1．2 温度对于发酵过程影响的动力学分析
2．1．3 变温发酵策略
2．1．4 不同培养模式的比较
2．2 pH对弹性蛋白酶分批发酵的影响
2．2．1 培养过程中未控制pH的弹性蛋白酶分批发酵
2．2．2 恒定pH分批发酵过程分析
2．2．3 pH分段控制策略的探讨
2．3 搅拌转速对弹酶分批发酵的影响
2．3．1 搅拌转速对生物量的影响
2．3．2 搅拌转速对酶活力的影响
2．3．3 搅拌转速对残糖的影响
2．3．4 搅拌转速对泡沫的影响
2．3．5 搅拌转速对发酵过程影响的动力学分析
3 小结
第三章 70L发酵罐分批发酵及动力学模型的建立
0 引言
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．2 培养基与培养方法
1．2．1 培养基
1．2．2 培养方法和发酵条件
1．3 分析方法
1．4 主要仪器
2 Bacillus sp. EL31410中试扩大培养和动力学模型的建立
2．1 Bacillus sp. EL31410中试扩大培养
2．2 发酵动力学模型的建立
3 结果和讨论
3．1 Bacillus sp. EL31410中试扩大培养发酵过程分析
3．2 动力学模型的建立及各参数的估计
3．2．1 Bacillus sp. EL31410生长动力学
3．2．2 弹性蛋白酶生成动力学
3．2．3 葡萄糖消耗动力学
4 小结
第四章 弹性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究
0 引言
1 材料和方法
1．1 实验菌株
1．2 主要仪器
1．3 发酵培养基和培养方法
1．4 分析方法
1．5 盐析及分级盐析方法
1．6 离子交换柱层析
1．7 凝胶过滤柱层析
1．8 弹性蛋白酶酶学性质研究方法
1．8．1 弹性蛋白酶热稳定性的测定
1．8．2 弹性蛋白酶pH稳定性的测定
1．8．3 金属离子对弹性蛋白酶活性的影响
1．8．4 弹性蛋白酶降解其他蛋白
1．8．5 SDS-PAGE电泳
2 结果与分析
2．1 弹性蛋白酶的纯化
2．1．1 盐析法
2．1．2 DEAE-Sephadex A 50离子交换柱层析
2．1．3 凝胶过滤层析
2．2 弹性蛋白酶酶学性质分析
2．2．1 弹性蛋白酶纯度及分子量的测定
2．2．2 酶的最适作用温度和热稳定性
2．2．3 酶的最适作用pH和酸碱稳定性
2．2．4 金属离子对酶活性的影响
2．2．5 弹性蛋白酶对天然蛋白质的分解
3 小结
第五章 弹性蛋白酶的热稳定性及保存寿命估算
0 引言
1 材料和方法
1．1 弹性蛋白酶粗酶液的制备
1．2 主要仪器
1．3 保护剂的筛选
1．4 复合保护剂的添加对于弹性蛋白酶热稳定性的影响
1．5 复合保护剂的添加对于弹性蛋白酶pH稳定性的影响
1．6 弹性蛋白酶制剂的加速试验
1．7 检测方法
2 结果与分析
2．1 不同物质对弹性蛋白酶热稳定性的影响
2．2 保护剂浓度对弹性蛋白酶热稳定性的影响
2．3 复合保护剂配方的优化
2．4 复合保护剂的添加对于弹性蛋白酶热稳定性的影响
2．5 复合保护剂的添加对于弹性蛋白酶pH稳定性的影响
2．6 加速试验估算弹性蛋白酶的贮存寿命
2．6．1 弹性蛋白酶的热降解速度
2．6．2 弹性蛋白酶的贮存寿命估算
3 小结
第六章 双水相体系纯化弹性蛋白酶
0 引言
1 材料和方法
1．1 仪器设备
1．2 粗酶液的制备
1．2．1 培养基
1．2．2 培养方法
1．3 双水相体系的制备
1．4 分析方法
1．5 试验设计
1．5．1 全因子试验
1．5．2 最陡爬坡试验
1．5．3 中心组合试验
1．6 主要评价指标
1．7 从PEG中回收弹性蛋白酶
2 结果与讨论
2．1 PEG／盐体系的选择
2．2 pH对PEG／KH_2PO_4-K_2HPO_4体系中弹性蛋白酶分配的影响
2．3 PEG分子量对PEG／磷酸盐体系中弹性蛋白酶分配的影响
2．4 NaCl对于PEG／磷酸盐体系中弹性蛋白酶分配的影响
2．5 PEG和磷酸盐浓度对弹性蛋白酶分配的影响
2．5．1 全因子试验设计(FFD)与分析
2．5．2 最陡爬坡试验
2．5．3 中心组合试验设计(CCD)及响应面分析
3 弹性蛋白酶的回收
4 小结
第七章 弹性蛋白酶水解丝素蛋白
0 引言
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 可溶性丝素粉末的制备
1．1．2 酶制剂
1．1．3 主要仪器
1．2 方法
1．2．1 水解物的制备
1．2．2 氨基含量及水解度的测定
1．2．3 水解物肽的分子量分布分析方法
2 结果和讨论
2．1 几种蛋白酶对丝素的水解作用
2．1．1 纯化弹性蛋白酶对精练丝素和可溶性丝素水解能力的比较
2．1．2 酶水解进程曲线
2．2 Bacillus sp. EL31410的弹性蛋白酶水解丝素的条件确定
2．2．1 底物浓度对酶促反应的影响——动力学常数的测定
2．2．2 E／S对酶促反应的影响
2．2．3 温度对酶促反应的影响
2．2．4 pH对酶促反应的影响
2．3 高水解度丝素肽的相对分子量分布
3 小结
第八章 弹性蛋白酶的安全性实验
0 引言
1 材料和方法
1．1 实验材料
1．2 实验动物和检测条件
1．3 实验方法
2 结果与讨论
3 小结
结论与展望
参考文献
致谢
附录
发布时间: 2005-07-15
参考文献
- [1].弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究[D]. 陈启和.浙江大学2003
- [2].弹性蛋白酶优良菌种选育及酶功能特性研究[D]. 李洪军.西南农业大学2003
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- [3].根霉纤溶酶发酵、纯化和酶学性质研究[D]. 刘晓兰.天津科技大学2004
- [4].胶原蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究[D]. 杨光垚.四川大学2004
- [5].枯草芽孢杆菌B53的分离鉴定及产聚γ-谷氨酸的研究[D]. 惠明.中国农业大学2005
- [6].法夫酵母虾青素发酵条件的优化及提取与分析研究[D]. 倪辉.浙江大学2005
- [7].发酵法生产米多霉素的菌种选育、培养条件优化和动力学研究[D]. 谢志鹏.浙江大学2005
- [8].纳他霉素高产菌株选育、发酵条件优化、发酵动力学及溶解度的研究[D]. 骆健美.浙江大学2005
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