酵母菌3-磷酸甘油脱氢酶基因（gpd1）的克隆及其在高渗胁迫下mRNA转录水平的差异

论文摘要

环境渗透压的变化对于酵母细胞的生存有着十分重要的影响。当酵母菌处于高渗透压环境中的时候,酵母菌的生存将受到极大的威胁。在这个时候酵母菌可以通过增加胞内甘油的积累水平来减小细胞膜内外的渗透压差以实现对高渗胁迫的适应。GPD1是一个由391个氨基酸组成的蛋白质,它能催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油,在酵母细胞适应高渗透压胁迫的过程中起着重要的作用。高渗胁迫下GPD1的表达量和它的酶活力都将会有一定程度的上升,而且gpd1基因的突变会直接导致酵母细胞无法在高渗环境中生长。 本研究选取生产中常用的酵母菌株YY、FHS和WFB,通过实验分析造成三种酵母菌株抗高渗能力差异的原因。首先分别用浓度为1%、3%、5%的NaCl对酵母菌株YY、FHS和WFB进行处理比较高渗胁迫对这三个菌株生长速度的影响。结果发现:在NaCl的浓度为1%和3%时,NaCl对FHS菌株生长速度的影响明显小于YY和WFB菌株;另外,在NaCl的浓度为1%时,NaCl对YY菌株生长速度的影响明显小于WFB菌株;当NaCl的浓度为5%时,NaCl对这三个菌株生长速度影响的强弱依次为WFB、FHS、YY,但差距并不明显。由此可以看出,FHS菌株耐高渗能力最强、YY菌株次之、WFB菌株最差。 分别克隆酵母菌株YY、FHS和WFB的gpd1基因片段并测序,分析这三个酵母菌株gpd1基因序列的差异。用生物学软件Vector NTI将YY、FHS和WFB gpd1基因序列与国际基因库（Gene Bank）中的gpd1序列（X76859）进行对比,发现其同源性分别为99.32%、99.83%、99.83%。将这些DNA序列转化为氨基酸序列,再用Vector NTI比对这些氨基酸序列,结果发现受检菌株YY、FHS gpd1基因序列对应的氨基酸序列与Gene Bank中gpd1序列（X76859）对应的氨基酸序列完全一致,而WFB与它们的同源性只有98.5%。 分别用浓度为1%、3%、5%的NaCl对酵母菌株YY、FHS和WFB进行处理,比较高渗胁迫对这三个菌株gpd1基因的mRNA转录水平的影响,从gpd1基因的mRNA转录水平的角度分析造成三个酵母菌株抗高渗能力差异的原因。通过RNA点杂交显示YY、FHS菌株gpdl基因的mRNA转录水平在NaCl浓度上升时候有上升的趋势:WFB菌株gpd1基因的mRNA转录水平随NaCl浓度的上升逐渐降低。实验结果显示,gpd1基因mRNA转录水平与抗高渗能力相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 环境的渗透压对酵母生存的影响
• 1.2 甘油在酵母菌适应高渗环境过程中发挥的作用
• 1.3 高渗胁迫下酵母增加胞内甘油积累的方式
• 1.3.1 通过合成代谢途径增加甘油的积累
• 1.3.2 降低甘油通过细胞膜的速度
• 1.3.3 调控甘油的分解代谢过程
• 1.3.4 从环境中摄取甘油
• 1.4 3—磷酸甘油脱氢酶基因（gpd1）酵母抗高渗过程中的作用及其调控机制
• 2 本研究的目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、试剂和仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂及试剂盒
• 3.1.3 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 酵母基因组DNA的提取
• 3.2.2 以酵母基因组DNA为模板的PCR扩增
• 3.2.3 扩增产物的纯化与克隆
• 3.2.4 测序克隆片段测序与氨基酸序列分析
• 3.2.5 RNA的点杂交
• 3.2.6 酵母菌株在高渗胁迫下生长速度的检测
• 3.2.7 点杂交样品的处理
• 4 结果与分析
• 4.1 酵母菌株YY、FHS、WFB耐高渗能力的强弱
• 4.2 gpd1基因克隆
• 4.2.1 酵母基因组DNA的提取
• 4.2.2 以酵母基因组DNA为模板的PCR扩增
• 4.2.3 将回收的PCR片段与T载体连接并转化到宿主菌
• 4.2.4 筛选并鉴定阳性克隆子
• 4.3 克隆片段与gpd1序列（X76859）间同源性分析
• 4.4 在高渗胁迫下这酵母菌株YY、FHS和WFB的gpd1基因mRNA转录水平的差异
• 4.4.1 探针标记效果的检测
• 4.4.2 对酵母菌株渗透胁迫处理并检查抽提 RNA的质量
• 260的数值计算上样量'>4.4.3 检测样品OD₂₆₀的数值计算上样量
• 4.4.4 点杂交分析样品mRNA的转录水平的变化趋势
• 5 讨论
• 5.1 菌株耐高渗能力与其gpd1基因序列的关系
• 5.2 gpd1基因mRNA转录水平的变化趋势与菌株的抗高渗能力的关系
• 5.3 未来工作的方向
• 参考文献
• 致谢
• 附录