拟无枝菌酸菌CP2808中Ansacarbamitocins的生物合成

论文摘要

美登素属于大环内酰胺类安莎霉素,自发现以来一直作为非常有潜力的抗肿瘤药物进行研究。随着抗体与靶向分子结合技术的发展,美登素作为高效的细胞毒性剂,可以弥补因抗体剂量不足而无法彻底抑制肿瘤的弊端。2007年Dow Agroscience在Amycolatopsis sp. CP2808菌株中发现了具有抗真菌活性的美登素类抗生素ansacarbamitocins。为了比较安丝菌素与ansacarbamitocins在生物合成途径上的区别,首先构建了Amycolatopsis sp. CP2808菌株fosmid基因组文库。利用高度保守的AHBA合成酶基因作为探针筛选出阳性质粒23B4。再通过染色体步移筛选出阳性克隆30C3和9C12。3个克隆整合后得到108.5 kb的序列并定位了anscarbamitocins生物合成基因簇。这个基因簇涵盖了ansacarbamitocins生物合成的必需基因。包括了:6个负责AHBA合成基因,4个聚酮合酶基因,5个负责“glycolate”特使延伸单位的合成基因,6个后修饰基因和2个可能参与调控的基因。与安丝菌素生物合成基因簇相比较新的基因簇有着比较明显的不同点:一是氨甲酰基转移酶基因在ansacarbamitocins生物合成基因簇比在安丝菌素生物合成基因簇多1个拷贝;二是AHBA合成酶基因在ansacarbamitocins基因簇有1个拷贝,而在安丝菌素生物合成基因簇中有2个。通过Redirect Technology对基因acm21a、acm21b、acm25和acm21a/acm21b进行了基因中断实验。对4个突变株进行发酵并检测后,能够清晰的找出acm21b以及acm25的中断结果。并推测出氨甲酰基转移酶Acm21b在氯代酶Acm12之后催化了C6、C9位氨甲酰化及噁嗪环的形成。糖基转移酶Acm25在氯代酶Acm12、氨甲酰基转移酶Acm21a和Acm21b、环氧化酶Acm11之后催化N上的糖基化取代。对安丝菌素基因簇中2个AHBA合成酶基因asm24和asm43,通过基因中断实验分别检测两个基因与安丝菌素生物合成的相关性,发现asm43与安丝菌素的生物合成关系更加密切。通过以上对于ansacarbamitocins以及安丝菌素生物合成相关基因的研究,确定了ansacarbamitocins的生物合成基因簇,并初步解释了该类化合物的生物合成途径,基本确定了ansacarbamitocins C-3位酯基可能是由一个氨甲酰基转移酶负责,为安莎类抗生素的改造以及生产效率的提高奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 美登素类化合物研究进展（综述）
• 1.1 美登素类抗生素概述
• 1.1.1 美登素的生物资源
• 1.1.2 生物活性
• 1.1.3 生物代谢
• 1.1.4 美登素在抗体靶向结合技术中的应用
• 1.2 美登素类抗生素的生物合成
• 1.2.1 AHBA 的生物合成
• 1.2.2 安丝菌素前体的合成
• 1.2.3 甲氧基丙二酰-酰基载体蛋白的生物合成
• 1.2.4 后修饰反应
• 1.3 新一类衍生物ansacarbamitocins
• 1.4 试验目的、意义及内容
• 1.4.1 本研究的目的和意义
• 1.4.2 本研究主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验菌种与质粒
• 2.2 实验试剂
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 实验试剂
• 2.3.3 抗生素及诱导剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.4 菌体培养与菌种保藏
• 2.3.5 大肠杆菌质粒DNA 大量提取
• 2.3.6 放线菌总DNA 的少量提取
• 2.3.7 Fosmid 文库建立
• 2.3.8 基因组文库筛选
• 2.3.9 DNA 沉淀
• 2.3.10 DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.11 DNA 片段凝胶回收
• 2.3.12 DNA 片段的酶切与连接
• 2.3.13 钙转感受态的DNA 转化
• 2.3.14 电转感受态细胞制备及DNA 转化
• 2.3.15 Redirect 技术
• 2.3.16 Actinosynnema pretiosum 菌株的接合转移
• 2.3.17 Actinosynnema pretiosum 菌株的发酵与产物检测
• 2.3.18 Amycolatopsis sp. CP2808 菌株的接合转移操作
• 2.3.19 Amycolatopsis sp. CP2808 菌株的发酵与产物检测
• 第3章 Ansacarbamitocins 生物合成基因簇的克隆
• 3.1 前言
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Amycolatopsis sp. CP2808 基因组文库的构建
• 3.2.2 带有AHBA 合成酶基因的克隆筛选与验证
• 3.2.3 合成基因簇的染色体步移筛选
• 3.3 小结与讨论
• 3.3.1 小结
• 3.3.2 讨论
• 第4章 Ansacarbamitocins 生物合成基因簇的分析
• 4.1 前言
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 阳性克隆序列信息的整合
• 4.2.2 基因簇序列分析
• 4.2.3 与安丝菌素合成基因簇的比较
• 4.3 小结与讨论
• 4.3.1 小结
• 4.3.2 讨论
• 第5章 Ansacarbamitocins 生物合成后修饰途径的研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验结果与分析
• 5.2.1 基因置换质粒构建
• 5.2.2 acm21a 突变株的构建与验证
• 5.2.3 acm21b突变株的构建与验证
• 5.2.4 acm21ab 突变株的构建与验证
• 5.2.5 acm25 突变株的构建与验证
• 5.3 小结与讨论
• 5.3.1 小结
• 5.3.2 讨论
• 第6章 AHBA合成酶在安丝菌素生物合成过程中的相关性
• 6.1 前言
• 6.2 实验结果与分析
• 6.2.1 A. pretiosum 中AHBA 合成酶的生物信息学功能分析
• 6.2.2 asm24 中断突变株的构建与验证
• 6.2.3 asm43 中断突变株的构建与验证
• 6.2.4 asm24 与asm43 突变株的发酵检测
• 6.2.5 asm24、asm43 双缺失突变株的构建
• 6.3 小结与讨论
• 6.3.1 小结
• 6.3.2 讨论
• 第7章 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 后续工作
• 7.3 展望
• 参考文献
• 致谢