论文摘要
目的:多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）属于恶性浆细胞病,仍为不可治愈的恶性肿瘤。IL-6在促进骨髓瘤细胞增殖中起重要作用。硼替佐米（Bortezomib,BZ）是一种蛋白酶体抑制剂,在治疗MM疾病中取得显著疗效,其单药总体缓解率约40%左右。丙戊酸钠（Valproic acid ,VPA）属于组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor,HDACI）,临床普遍用于抗癫痫治疗,其潜在的抗肿瘤作用受到关注。国外研究显示VPA可促进MM细胞株凋亡。Pim-2激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,是一种和肿瘤发生相关的原癌基因,可在多种有丝分裂信号刺激下被激活,导致造血细胞恶变。Bcl-2基因是已知的抗凋亡的基因,其指导合成的蛋白是控制线粒体促凋亡因子释放的主要调节因子。Bax与Bcl-2同属于Bcl-2蛋白家族成员,Bax基因则是与之相对的促凋亡基因,Bax与Bcl-2的平衡关系调控着细胞的凋亡。本实验选用非依赖IL-6的MM细胞株PRMI8226及依赖IL-6的MM细胞株U266,从细胞生长增殖、凋亡及Bcl-2、Bax和Pim-2基因表达等细胞生物学行为的角度,探讨BZ联合VPA对MM细胞株增殖和凋亡的影响及Bcl-2、Bax和Pim-2基因表达变化,为临床寻找新的BZ联合治疗方案提供理论依据。方法:1细胞株培养:常规培养人MM细胞株RPMI8226及U266。RPMI8226细胞每48小时传代1次,U266细胞每72小时传代1次,实验用对数生长期的细胞。2 MTT法检测细胞增殖:调整细胞密度RPMI8226细胞为4×104/ml,U266细胞为2×105/ml分别接种于96孔无菌培养板中,每孔180μl,BZ单药分别作用于RPMI8226及U266细胞的浓度为>0.1×10-6mol/l时,两种细胞的增殖抑制率出现明显增加。故将BZ的浓度选定为0.1×10-6mol/l。VPA单药作用于RPMI8226及U266细胞的浓度分别为2、4、8、16、32、64mmol/l,随着VPA浓度的增加细胞生长抑制率逐渐增加,并于16mmol/l及32mmol/l时抑制率增加趋势较明显。实验选用VPA的最终浓度为2mmol/l,16mmol/l,32mmol/l进行实验。将实验分为五组:A/A’组:对照组;B/B’组:BZ 0.1×10-6mol/l;C/C’组:BZ 0.1×10-6mol/l+VPA 2mmol/l ; D/D’组: BZ 0.1×10-6mol/l+VPA 16mmol/l;E/E’组:BZ 0.1×10-6mol/l+VPA 32mmol/l。依据RPMI8226及U266细胞的生长周期,RPMI8226细胞（A、B、C、D、E组）分别取12h,24h,36h时间点,U266细胞（A’、B’、C’、D’、E’组）分别取12h,24h,48h时间点,用MTT法检测细胞增殖情况。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值,以OD值间接反映存活细胞数量,计算细胞生长抑制率=[（对照组OD-实验组OD）/对照组OD]×100%。每组设立四个复孔。3 AnnexinV/PI法检测细胞凋亡:调整RPMI8226及U266密度为2-5×105/ml,应用MTT实验所拟定的五组药物浓度,相同作用时间点收集各组细胞,AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡。4半定量RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA表达:收集各组RPMI8226细胞和U266细胞,提取总RNA,并检测RNA的OD260值、浓度及OD260/OD280值,RNA电泳检测RNA完整性。逆转录合成cDNA。Bcl-2上游引物: 5′-GACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3′,下游引物: 5′- GCATCCCAGCCTCCGTTATCC -3′,片段长度260bp。Bax上游引物:5’- TTTGCTTCAGGGTTTCATCCAGG -3’ ,下游引物: 5’- GAGCTCCATGTTACTGTCCAGTTCG-3’,片段长度154bp。β-actin上游引物:5’- GTGACATTAAGGAGAAGCTG -3’ ,下游引物:5’- CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’,片段长度:510bp。PCR反应体系为25μl。电泳结果在读胶仪AlphaImager1200上扫描扩增产物,并用Gel pro软件对Bcl-2、Bax mRNA的平均吸光度值与β-actin mRNA的平均吸光度值比较,进行半定量分析。5半定量RT-PCR法检测pim-2 mRNA表达:实验方法同前,Pim-2上游引物: 5′-CAGCCATCCAGCACTGCCATTC-3′,下游引物: 5′-AGTCTGGGGAGACATGGGCTGG-3′,片段长度330bp。6统计学分析SPSS 13.0软件分析,分组资料以均数±标准差表示,两组应用T检验方法,多组进行双因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 BZ联合VPA对RPMI8226细胞增殖的影响VPA单药作用RPMI8226细胞,随着浓度增加增殖抑制率逐渐增加。VPA的浓度由2mmol/l到64mmol/l时,生长抑制率由7.9%增加到34.7%,（P=0.005）。BZ单药的浓度>0.1×10-6mol/l时,对RPMI8226增殖抑制率有明显增高趋势;BZ与VPA药物联合处理的RPMI8226细胞,12h生长抑制率由B组到E组显著增加（P=0.000）;24h的细胞生长抑制率分别为B组0.2808±0.0273,C组0.4109±0.0363,D组0.4504±0.0581,E组0.5142±0.0137,组间存在显著差异（P=0.000）;36h的细胞生长抑制率亦有相同趋势（P=0.047）。提示BZ联合VPA对RPMI8226生长抑制率随着VPA浓度的增加逐渐增加,呈剂量依赖性。同时12h、24h、36h三个不同时间点相同药物浓度下的细胞生长抑制率之间亦有明显差别（P均<0.05）,提示随着时间的延长抑制增殖效应逐渐增加,呈时间依赖性。研究发现VPA的浓度为32mmol/l时联合BZ 0.1×10-6mol/l作用RPMI8226细胞36h,细胞的生长抑制效应最大,抑制率为0.5142±0.0137。2 BZ联合VPA对U266细胞增殖的影响:VPA单药作用U266细胞,随浓度增加生长抑制率逐渐增加,但各浓度的抑制率均小于RPMI8226细胞。当VPA浓度为16mmol/l64mmol/l时差别较明显,RPMI8226 VS U266:23.1%34.7% VS 17.27%28.6%。BZ单药浓度>0.1×10-6mol/l时对U266细胞抑制率有明显增高趋势。联合用药12h时及24h时细胞的生长抑制率随着VPA浓度增加而显著增加组间均存在显著差异（P值均= 0.000）;48h的细胞生长抑制率分别为B’组0.2927±0.0232,C’组0.3194±0.0428,D’组0.6008±0.0645,E’组0.7819±0.0462,组间亦存在显著差异（P=0.000）。显示BZ联合VPA对U266细胞的生长抑制亦呈剂量依赖性。12h、24h、48h三个不同时间点时,相同药物浓度下的细胞生长抑制率之间有明显差别（P均<0.05）,两种药物联合对U266细胞的抑制增殖效应呈时间依赖性。且VPA的浓度2mmol/l时联合BZ作用U266细胞,较BZ单用抑制率无差别（P=0.356）。两种细胞之间进行抑制率比较,提示BZ联合VPA对U266细胞的增值抑制率与RPMI8226细胞无明显差异（P=0.599）。3 AnnexinV/PI法检测细胞凋亡在RPMI8226细胞中,药物联合的五组不同浓度作用12h时,细胞的凋亡率分别为:A组26.6000±1.1000,B组25.1667±3.5232,C组33.0333±2.4583,D组37.8333±0.6110,E组41.4000±1.0392;24h细胞凋亡率分别是:A组36.2333±3.1628,B组39.8000±0.4358,C组47.1666±2.2810,D组50.5333±1.6258,E组52.0333±1.4640;36h细胞凋亡率分别是:A组54.0666±3.4122,B组61.8333±1.2741,C组64.4000±1.2124,D组66.2000±0.9539,E组68.5000±1.0392,各时间点组间比较P值均<0.05,提示随着药物作用时间或浓度增加细胞凋亡率逐渐增加。在U266细胞中药物不同浓度作用细胞12h的细胞凋亡率分别是:A’组24.0333±2.5658,B’组24.4666±1.2741,C’组26.1000±1.05356,D’组32.1000±1.2165,E’组32.7333±0.6429;24h的细胞凋亡率分别是: A’组22.3000±0.8000,B’组24.2666±1.1150,C’组34.3333±1.2662,D’组47.4666±0.9073,E’组54.6000±1.05366;48h的细胞凋亡率分别是:A’组23.2666±1.4011,B’组25.0666±2.4172,C’组49.3000±0.5196,D’组63.0333±1.3868,E’组65.4000±1.0817,提示U266细胞的凋亡率随着药物作用浓度及作用时间的延长逐渐增加（P值均<0.05）。单用BZ组（B’组）随着时间的增加细胞凋亡率增加不明显,而联合用药组（C’、D’、E’组）细胞凋亡率有明显浓度及时间依赖性。两细胞株之间比较,在RPMI8226细胞中,E组细胞36小时后,凋亡的作用最明显。最大凋亡率为68.5000±1.0392,较对照组增加14.5%;在U266细胞中,E’组细胞48小时后,凋亡作用最明显,最大凋亡率65.4000±1.0817,较对照组增加42.2%。两种细胞之间进行凋亡率比较,提示BZ联合VPA对U266细胞的诱导凋亡作用较RPMI8226细胞明显（P=0.003）。4 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA在骨髓瘤细胞株中的表达Bcl-2 mRNA在骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞中均呈阳性表达。在RPMI8226细胞中,24h Bcl-2 mRNA表达量依次为:A组1.280±0.160;B组0.607±0.035;C组0.410±0.105;D组0.355±0.029;E组0.275±0.400,提示随着药物作用浓度的增加Bcl-2 mRNA表达量逐渐下降（P<0.01）。在U266细胞中24h Bcl-2 mRNA表达量依次为:A’组0.656±0.013;B’组0.543±0.025;C’组0.437±0.121;D’组0.259±.070;E’组0.136±0.197,随着VPA药物作用浓度的增加Bcl-2 mRNA表达量亦逐渐下降（P<0.01）。Bax在U266细胞中表达为阳性。药物作用24h Bax mRNA表达量依次为:A’组0.573±0.011;B’组0.656±0.032;C’组0.146±0.007;D’组0.089±0.017;E’组0.123±0.006,各组数值的比较P均<0.05,但无明显减低趋势。其意义不明。5 Pim-2 mRNA在RPMI8226及U266中的表达以K562白血病细胞株为阳性对照,U266细胞Pim-2 mRNA呈现阳性表达,但不同药物浓度对Pim-2 mRNA表达无显著影响（P=0.447）。在RPMI8226细胞中,未检测到Pim-2 mRNA。结论:1 BZ联合VPA可抑制RPMI8226及U266骨髓瘤细胞株增殖,并促进其凋亡,其作用较单用BZ增加,并呈剂量和时间依赖性。2 BZ联合VPA对IL-6依赖的U266细胞促凋亡作用较非IL-6依赖的RPMI8226细胞明显。3在BZ联合VPA情况下,Bcl-2 mRNA表达量在RPMI8226及U266两种细胞株中均随VPA浓度的增加而减少。Bax mRNA表达量在U266细胞株中随VPA浓度的变化无减低趋势。4 U266细胞中Pim-2 mRNA表达呈阳性,不同药物浓度对Pim-2 mRNA表达量无明显影响;RPMI8226细胞中不表达pim-2 mRNA。