黄连素对人肺腺癌A549细胞株的体外作用研究

论文摘要

目前,癌症（cancer）是严重威胁人类健康的一类疾病,寻找有效的抗癌药物与方法,彻底攻克癌症,是世界医学界重要的研究课题。由于多数合成药物缺乏选择作用,在伴随治疗中长出现明显的副作用,因此,天然药物越来越受到人们的重视和青睐。黄连素（bererine）是从毛茛科植物黄连（coptischinese）等植物中提取出来的季胺类化合物,属于异哇琳生物碱,是常用的中药之一,临床上主要用来清热解毒和抗菌消炎。近年来的研究结果表明,黄连素还具有诱导细胞凋亡的生物和药理学活性,且毒副作用较低。虽然黄连素的抗肿瘤作用己经引起了各国学者的广泛关注,但是对于黄连素抗肿瘤的作用机制仍然没有一个明确的说法,迫切需要对其进行系统的研究。阐明黄连素体外抗肿瘤的作用机制,对于开发黄连素抗肿瘤的药用功能,指导其临床用药具有重要意义。本课题旨在研究黄连素体外对于肺腺癌A549细胞的凋亡诱导及迁移、黏附作用,为寻找治疗肺腺癌及抑制肿瘤转移的天然药物提供有价值的线索。在细胞凋亡方面,本研究利用MTT法观察黄连素对A549细胞的生长抑制作用,采用荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡特征。结果显示,黄连素能够抑制A549细胞的生长,并呈一定的量效和时效关系;作用细胞出现典型的细胞凋亡特征。通过分析癌基因bcl-2,Bax,p53的mRNA和蛋白质水平的表达情况,发现影响癌基因的表达是黄连素诱导肺腺癌A549细胞凋亡的途径之一。在细胞迁移和黏附方面,本研究通过在体外建立细胞外基质模型,利用划痕试验和黏附试验观察黄连素作用前后细胞迁移和黏附能力的变化。结果显示,不同浓度的黄连素能够抑制A549细胞的扩散,细胞的迁移率和黏附率明显降低,并且呈现剂量依赖性（P<0.05）。通过半定量RT-PCR法和明胶酶谱法分别检测基质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）的mRNA表达和蛋白质的活性,发现黄连素抑制A549细胞迁移和黏附的机制可能与下调基质金属蛋白酶（MMP2和MMP9）的mRNA表达,降低其活性有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 肺腺癌与细胞凋亡
• 1.2 肺腺癌与细胞扩散
• 1.2.1 细胞外基质的成分
• 1.2.2 细胞外基质的生物学活性
• 1.2.3 基质金属蛋白酶（MMPs）
• 1.3 黄连素的抗肿瘤研究现状
• 1.4 本论文的研究意义
• 2 试验仪器及试剂
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验设备
• 2.3 主要试剂
• 2.4 试验所需试剂的配制
• 2.5 培养用品的清洗和消毒
• 3 黄连素对肺腺癌A549 细胞生长抑制作用
• 3.1 试验方法
• 3.1.1 A549 细胞的体外培养、传代、冻存及复苏
• 3.1.2 A549 细胞生长曲线的建立
• 3.1.3 台盼蓝拒染法检测A549 活细胞百分率
• 3.1.4 MTT 法检测黄连素对A549 细胞的生长抑制作用
• 3.1.5 黄连素对A549 细胞凋亡作用的初步观察
• 3.1.6 AO/EB 染色法观察细胞形态
• 3.1.7 DNA Ladder 检测
• 3.1.8 半定量RT-PCR 法检测Bax、bcl-2、p53 mRNA 表达
• 3.1.9 western-blot 法检测Bax、bcl-2、p53 的蛋白表达
• 3.1.10 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 A549 细胞生长状况
• 3.2.2 MTT 法检测细胞生长抑制作用
• 3.2.3 倒置显微镜下观察细胞形态
• 3.2.4 荧光显微镜观察细胞形态
• 3.2.5 DNA Ladder 检测结果
• 3.2.6 半定量RT-PCR 法检测Bax、bcl-2、p53 的mRNA 水平表达结果
• 3.2.7 western-blot 法检测Bax、bcl-2、p53 的蛋白表达结果
• 3.3 讨论
• 4 黄连素对肺腺癌A549 细胞迁移与黏附影响的试验研究
• 4.1 试验方法
• 4.1.1 划痕试验
• 4.1.2 黏附试验
• 4.1.3 半定量RT-PCR 法检测MMP2、MMP9 的mRNA 表达
• 4.1.4 明胶酶谱法检测MMP2、MMP9 的活性变化
• 4.2 结果
• 4.2.1 划痕试验结果
• 4.2.2 黏附试验结果
• 4.2.3 半定量RT-PCR 法检测MMP2、MMP9 的mRNA 表达结果
• 4.2.4 明胶酶谱法检测MMP2、MMP9 的活性变化结果
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间已发表论文
• 作者简历
• 致谢