脂联素在L-02细胞中对肝糖代谢信号转导机制的研究

论文摘要

目的：在人肝细胞株L-02中获取具有生物学活性的脂联素重组蛋白的分泌性表达,并在L-02细胞中探讨脂联素抑制糖异生的信号转导机制。方法：①从人脂肪组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法得到人脂联素基因cDNA序列,自行设计引物一对,经PCR扩增人脂联素基因完全编码序列,构建pMD18-T/ADPN重组克隆质粒,目的序列测序鉴定；PCR扩增脂联素目的片段,连至真核表达载体pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO,构建脂联素真核表达质粒pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN。②将pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN转化入TOP10感受态细胞,筛选可能含有阳性克隆的白色菌落进行鉴定,提取阳性克隆中的重组质粒,命名为pCDNA3.1-ADPN。③将pCDNA3.1—ADPN经脂质体介导、G418筛选后转染至人肝细胞株L-02,免疫荧光法观察转染率,收获的细胞裂解液及细胞培养上清经SDS-PAGE、western blot、细胞免疫组织化学法检测脂联素表达情况。④用含0 mmol/L、5 mmol/L、15 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖的培基分别模拟无糖、低糖、中糖、高糖环境。将转染pCDNA3.1—ADPN的L-02细胞和对照组分别在上述环境中处理24 h,酶学法测定培养基血糖,观察重组脂联素蛋白的活性。⑤以western blot测定正常L-02组、转染组、30 mmol/L glucose处理组和“饥饿”组（72 h未换液）中phospho-AMPK、及其下游环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）、phospho-CREB蛋白表达情况,免疫组化法观察四组细胞中环腺苷酸反应元件结合蛋白辅激活物2（TORC2）的定位情况,葡萄糖脱氢酶偶联法测定葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）活性。结果：①成功构建脂联素克隆质粒pMD18-T/ADPN和真核表达质粒pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN（简称pCDNA3.1-ADPN）。②转染pCDNA3.1-ADPN的L-02细胞在免疫荧光显微镜下可见绿色荧光,表明转染成功,转染率在60%以上。③在细胞培养上清和沉淀中均检测到表达产物,表明重组蛋白利用自身信号肽获得分泌性表达。细胞裂解液和细胞培养上清中表达的重组蛋白分子量约为57 kD,具有人脂联素抗原性。④转染pCDNA3.1—ADPN的L-02细胞高糖（30mmol/L）处理24 h后其培基血糖低于对照组（p<0.05）,但在无糖、低糖和中糖环境中无明显差异（p>0.05）。⑤与其它组比较,转染组：phospho-AMPK蛋白表达升高（p<0.05）, TORC2主要在定位在细胞质中,G6P酶的活性显著降低（p<0.05）,但CREB、phospho-CREB蛋白表达无明显差异（p>0.05）。结论：我们成功构建了人脂联素真核表达质粒,并在人肝细胞株L-02中得到可溶性、分泌性表达,获得的重组蛋白具有生物学活性。脂联素抑制糖异生的机制可能与活化phospho-AMPK,抑制TORC2进入核内,从而抑制糖异生酶G6P的表达有关,其信号转导通路可能为Adiponectin-AMPK-CREB-TORC2-糖异生关键酶。这为进一步研究脂联素的信号通路,并探寻新的信号分子奠定了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 总体技术路线
• 一、脂联素真核表达质粒的构建及在L-02细胞中表达
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、脂联素调节肝糖异生信号转导机制的研究
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢