枯草芽孢杆菌金霉素耐药基因转移研究

论文摘要

抗菌药物作为动物促生长剂在带来巨大经济效益的同时也给人类带了巨大的危害,特别是导致药物残留和细菌耐药性的产生。益生菌制剂尤其是芽孢杆菌制剂,由于其良好的促生长作用以及低毒无残留的特性,近年来被广泛应用于畜牧业生产。益生菌的耐药性问题特别是其含有的耐药因子的转移所带来的危害还未引起人们足够的重视。本研究选取我国畜牧业生产实践中广泛使用的枯草芽孢杆菌和金霉素作为试验材料,研究金霉素对枯草芽孢杆菌的耐药选择作用,并通过耐药因子的转移试验研究枯草芽孢杆菌中金霉素耐药因子转移的可能性,为合理使用微生态制剂及制定相关政策提供参考依据。本研究选取枯草芽孢杆菌ATCC6633和金霉素作为研究对象,以添加金霉素的营养肉汤为诱导体系,采用升浓度连续诱导法进行诱导。诱导浓度从1/2MIC开始以倍增的方式递增,直至细菌无法在更高药物浓度的体系中生长。采用CLSI（美国临床和实验室标准化协会,原NCCLS）推荐的药敏试验方法测定诱导前后枯草芽孢杆菌对金霉素、四环素、土霉素、多西环素、头孢噻呋、氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星、呋喃妥因和利福平十种抗菌药物的MIC值。诱导四十一代后获得枯草芽孢杆菌金霉素耐药株BS1、BS2和BS3,MIC值分别为128μg/mL,32μg/mL,32μg/mL。与耐药前相比,三株耐药菌对四环素类四种药物（金霉素、四环素、土霉素、多西环素）的MIC值均有不同程度的升高,且均达到或超过耐药临界点。但诱导前后三株枯草芽孢杆菌对其它几种药物（头孢噻呋、氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星、呋喃妥因、利福平）的MIC值并无明显变化。根据Genebank中的相关序列运用primerpremier软件设计了四对引物pNS1981、tetBSR、GSY908、pNS1,分别提取三株耐药菌的质粒和基因组DNA并以此为模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物后发现BS1和BS2的质粒上含有四环素类药物耐药基因tet（K）,BS3中未扩增出目的基因。这表明由金霉素作用而导致枯草芽孢杆菌耐药的现象可能是由tet（K）在起主导作用,且其可介导枯草芽孢杆菌对四环素类药物的交叉耐药性。采用氯化钙法制备大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞,分别提取三株耐药枯草芽孢杆菌质粒进行转化实验,结果并未获得任何转化子。这表明耐药枯草芽孢杆菌所含耐药质粒可能不能通过转化的方式向大肠杆菌DH5α和BL21传递其耐药性。接合传递实验采用滤膜接合法,以三株耐药枯草芽孢杆菌为供体菌分别与大肠杆菌NK5449、肠球菌JH2-2进行接合实验。耐药菌与大肠杆菌NK5449的接合试验获得了三株接合子BS1-N,BS2-N,BS3-N,接合频率分别为4.57×10-7,1.4×10-7和1.3×10-8。药敏试验结果显示三株接合子对四环素类药物的MIC值较接合前受体菌均有不同程度的提高,且均达到或超过耐药临界点;而对其它几种抗菌药物的MIC值和转移前相比均未发生明显变化。分别提取三株接合子的质粒和基因组DNA并进行PCR扩增和检测后发现BS1-N质粒中含有tet（K）基因,而其它两株接合子中未扩增出目的基因。这表明tet（K）基因可以通过接合的方式由枯草芽孢杆菌向大肠杆菌进行转移。另外,耐药枯草芽孢杆菌中还可能含有未知耐药基因,并可通过接合或其它方式将耐药因子传递给大肠杆菌。三株耐药枯草芽孢杆菌与肠球菌的接合实验均未获得接合子,表明金霉素耐药枯草芽孢杆菌可能不能通过接合的方式向粪肠球菌传递其耐药性。从上述结果可知,枯草芽孢杆菌在长期接触金霉素的过程中可产生耐药菌,且获得的耐药菌对四环素类药物具有交叉耐药性。金霉素耐药枯草芽孢杆菌可通过接合的方式将其耐药因子向大肠杆菌进行转移,并使其获得对四环素类药物的耐药性,限制了四环素类药物在疾病治疗方面的应用,提高了治疗成本,从而加大了大肠杆菌相关疾病治疗失败的风险。这些都表明生产实践中使用微生态制剂时需要特别关注其耐药性及其耐药因子向其它细菌转移所带来的危害,政府相关部门应尽快制定相应的法规和规范以指导微生态制剂的合理安全使用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 立题依据
• 1.2 国内外研究进展
• 1.3 研究内容、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验菌株
• 2.2 抗菌药物
• 2.3 试剂
• 2.4 仪器设备
• 2.5 诱导前耐药表型及相关基因分析
• 2.5.1 MIC值测定
• 2.5.2 耐药基因扩增
• 2.5.3 耐药基因检测
• 2.6 体外诱导
• 2.7 诱导后耐药表型及相关基因分析
• 2.8 转化试验
• 2.8.1 转化受体菌耐药表型及相关基因分析
• 2.8.2 耐药因子转化
• 2.8.3 转化子耐药表型及相关基因分析
• 2.9 接合试验
• 2.9.1 接合受体菌耐药表型及相关基因分析
• 2.9.2 接合转移
• 2.9.3 接合子耐药表型及相关基因分析
• 3 结果与分析
• 3.1 诱导前MIC值
• 3.2 诱导过程中敏感性变化
• 3.3 诱导后MIC值
• 3.4 诱导前后耐药基因扩增
• 3.5 转化转移
• 3.5.1 大肠杆菌DH5α和BL21耐药表型及相关基因
• 3.5.2 耐药质粒转化
• 3.6 接合转移
• 3.6.1 大肠杆菌NK5449和肠球菌JH2-2耐药表型及相关基因
• 3.6.2 大肠杆菌NK5449接合
• 3.6.3 肠球菌JH2-2接合
• 3.6.4 接合子耐药表型及相关基因
• 4 讨论
• 4.1 耐药性产生规律
• 4.2 耐药机制
• 4.3 耐药因子转移机制
• 4.3.1 转化转移
• 4.3.2 接合转移
• 4.4 危害分析
• 5 小结
• 文献综述:抗菌药物耐药性转移研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录