CYP450和P-糖蛋白与双环醇及布格呋喃的相互作用

论文摘要

细胞色素P450 3A（cytochrome P450 3A,CYP3A）是参与人体内、外源性化合物包括药物生物转化的重要药物代谢酶,主要在肝脏和肠道表达。P-糖蛋白是依赖ATP的膜转运蛋白之一,在肠、肝、肾脏等脏器均高度表达。由于CYP3A与P-糖蛋白表达位置和底物高度交叉性,因此两者的联合作用在药物的吸收、转运和代谢中发挥关键作用,是影响生物利用度的重要因素。双环醇（4,4′-二甲氧基-5,6,5′,6′-双（亚甲二氧基）-2-羟甲基-2′-甲氧羰基联苯）是具有我国自主知识产权,治疗慢性病毒性肝炎的国家一类新药。临床实验结果显示,双环醇可明显改善慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者的临床症状及肝功能异常,同时兼有一定抗乙型肝炎病毒作用。前期药效学研究表明,双环醇对多种化学毒物如四氯化碳、D—半乳糖胺、脂多糖、刀豆蛋白A引起的化学性及免疫性肝损伤均有明显保护作用,其作用机制与调控前炎症因子及转导通路,抑制氧化损伤、保护线粒体功能密切相关。此外,药代动力学研究表明,双环醇水溶性差,口服给药后半衰期较短,生物利用度低,临床需要多次服药。双环醇在大鼠体内主要经CYP3A代谢,代谢产物为4-羟基双环醇和4′-羟基双环醇,与在人肝微粒体的代谢产物一致。布格呋喃（4-丁基-α-沉香呋喃）是中国医学科学院药物研究所研发的具有较强中枢镇静作用的抗焦虑新药。前期研究表明,布格呋喃口服后半衰期短,生物利用度较低（～8%）,多次给药对药物代谢Ⅰ相酶CYP1A、2E、3A、2C、2D和Ⅱ相酶GST及GR有不同程度的诱导作用。布格呋喃在大鼠体内主要经过CYP3A和CYP2E代谢,此外布格呋喃也是P-糖蛋白的底物之一。本论文应用Caco-2细胞、大鼠在体肠/肝灌流及体内药代动力学模型,探讨双环醇/布格呋喃口服生物利用度低的原因及分子机制,了解肠道和肝脏各自在上述药物首过效应中的作用。同时,比较双环醇/布格呋喃在正常和肝肾损伤大鼠肠/肝的吸收,代谢以及转运规律,研究两药与药物代谢酶和药物转运蛋白的相互作用,为深入了解新药在体内的生物转化机制和临床合理用药提供有实用价值的实验依据。研究结果表明:1.大鼠口服双环醇（200mg/kg）后5min血中即可检测到原形药,达峰时间为4.6h,达峰浓度为6.6μg/ml,AUC0→∞为18.5μg/ml·h。大鼠静脉注射双环醇（20mg/kg）后,全身清除率（CL）为33.1ml/min/kg,消除半衰期(T1/2)为0.7h,AUC0→∞为13.4μg/ml·h。由此计算大鼠口服双环醇的生物利用度为13.8%。此外,大鼠静脉注射双环醇（20mg/kg）24h内,胆汁和尿液中双环醇含量分别占给药量的0.3%和0.5%。上述结果提示,双环醇口服生物利用度低,且静脉注射后主要在肝脏发生生物转化。2.大鼠提前静脉注射CYP450抑制剂氨基苯并三唑（Aminobenzotriazole,ABT）50mg/kg或口服100mg/kg后,双环醇（200mg/kg）口服给药组大鼠的AUC(0→∞分别为223.1和456.8μg/ml·h,双环醇（20mg/ml）静脉注射给药组大鼠的AUC0→∞、CL和T1/2分别为65和58μg/ml·h、5.1和5.8ml/min/kg、5.3和6.5h,生物利用度分别为30.9和84%。以上结果表明,提前给予ABT（i.v或p.o）可通过抑制肠道或肠道和肝脏的CYP450活性,明显提高双环醇的口服生物利用度（1.2或5.1倍）。3.在大鼠single-pass肠灌流实验中可观察到肠系膜静脉血中双环醇累积量随灌流液中双环醇浓度（10、50、100μM）的增加而增加,分别为103、158和1547pm/cm2。如在双环醇（50μM）灌流液中分别加入P-糖蛋白,CYP3A以及CYP3A和P-糖蛋白的共同抑制剂LSN335984,醋竹桃酶素（Triacetyloleandomycin,TAO）和环孢素A（Cyclosporine A,CsA）后,大鼠肠系膜静脉血中双环醇累积量分别为508、2000和2110pm/cm2,与对照组比较分别增加3、12和16倍。而CYP3A的常用底物咪哒唑仑在加入LSN335984后,血中累积量无明显变化。此外,在加入LSN335984,TAO和CsA后,与对照组相比双环醇在肠道代谢分别减少9%、33%和36%。提示双环醇不仅是CYP3A的底物,同时也是P-糖蛋白的底物,CYP3A和P-糖蛋白的联合作用对双环醇在肠道吸收、转运和代谢的影响是造成双环醇口服生物利用度低的主要因素之一。4.双环醇（50μM）经Caco-2细胞的的吸收渗透系数(Papp)为1.6±0.3×10-5cm/s,摄取比（Extraction Ratio,ER）为1.94,加入LSN335984后上述参数降低49%。以上结果从体外细胞水平证实双环醇是P-糖蛋白底物的可能性。5.大鼠肝脏灌流实验发现,加入TAO和CsA后灌流液中双环醇的AUC0→1h和肝脏累积量明显增加;而加入LSN335984后胆汁中双环醇的累积量则明显减少。提示抑制肝脏CYP3A可明显减少双环醇代谢,而抑制P-糖蛋白后则使双环醇外排至胆汁中的药量减少。6.双环醇多次给药（200mg/kg,qd×7d）后对大鼠肝CYP1A和CYP2E的酶活性有一定诱导作用。RT-PCR结果表明,双环醇多次给药可在一定程度诱导肝CYP1A2、CYP3A2以及肠mdr1a mRNA的表达。此外,双环醇（10μM）体外对CYP1A、CYP2C、CYP2E和CYP3A活性有一定抑制作用,而双环醇（1μM）对大鼠上述各CYP450同工酶无明显影响。7.大鼠腹腔注射化学毒物四氯化碳（2.5ml/kg,i.p）后可造成急性肝损伤,表现为血清ALT和AST分别升高6.2和1.3倍。正常动物静脉注射双环醇（20mg/kg）后AUC0→∞和Cmax分别为13.4μg/ml·h和18.8μg/ml;而CCl4损伤组大鼠上述药代动力学参数均明显升高,AUC0→∞和Cmax为130μg/ml和33.1μg/ml·h,口服生物利用度增加了3.1倍。另将CCl4肝损伤大鼠进行肠循环灌流术后,可见肠系膜静脉血和灌流液中双环醇水平均明显增加,而肝灌流后胆汁中双环醇累积量减少75%。此外,CYP2C、CYP2E和CYP3A的特异性底物和双环醇本身在模型组大鼠肝微粒体中的代谢也明显减少。由此可见,肝损伤后双环醇在大鼠肠道的吸收和肝脏代谢明显改变,而且由于双环醇在体内主要经CYP3A代谢转化,因此推测参与双环醇代谢的CYP3A活性的减少可能是肝损伤大鼠双环醇口服生物利用度增加的主要原因。8.大鼠肌肉注射甘油（5ml/kg,i.m）后可造成急性肾损伤,同时肝功能也发生明显改变。与正常组比较,模型组大鼠血清中尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）分别升高8.3和4.2倍,ALT和AST也分别升高4.7和1.7倍。血浆药代动力学研究表明,正常动物口服双环醇（200mg/kg）后AUC0→∞和Cmax分别为21μg/ml·h和6.7μg/ml;而甘油损伤组大鼠上述药代动力学参数均明显升高,AUC0→∞和Cmax为81.9μg/ml·h和7.8μg/ml,口服生物利用度增加了3.6倍。由于肾损伤大鼠体内全身清除率无明显变化,推测肾脏损伤对双环醇的药代动力学影响不大,而肝脏功能明显受损,所以本实验选用肠/肝灌流模型用以观察双环醇在病理肾损伤大鼠药代动力学变化。肾损伤大鼠肠循环灌流实验中,肠系膜静脉血和灌流液中双环醇浓度的变化趋势与肝损伤模型相近,均明显增加。此外,CYP2C、CYP2E和CYP3A的特异性底物和双环醇在肾损伤大鼠肝微粒体中的代谢明显减少。9.在大鼠single-pass肠灌流模型中加入LSN335984、TAO和CsA后,大鼠肠系膜静脉血中布格呋喃累积量分别为73.4、82.9和98.3pm/cm2,与对照组比较分别增加3.9、4.6和5.6倍,代谢分别减少12%、11%和21%。上述结果表明,布格呋喃不仅是CYP450的底物,同时也是P-糖蛋白的底物,肠道CYP3A和P-糖蛋白的联合作用对布格呋喃吸收,转运和代谢的影响可能是导致布格呋喃口服生物利用度低的一个重要因素。10.在大鼠肝灌流模型中加入TAO和CsA灌流液中布格呋喃的AUC0→1h和肝累积量均明显增加;加入LSN335984后,胆汁中布格呋喃累积量则明显减少。提示抑制肝脏CYP3A可明显减少布格呋喃代谢,而抑制P-糖蛋白后则使布格呋喃在胆汁中外排量减少。11.在AHF大鼠肠道灌流模型中,肠灌流液和肠系膜静脉血中布格呋喃的量均显著增加。同时肝灌流液和肝组织中布格呋喃的量也明显升高。上述结果提示,肝组织和灌流液中布格呋喃水平的变化可能与AHF大鼠肝脏代谢能力降低有关。12.在ARF大鼠肠灌流模型中,肠系膜静脉血和肠组织中布格呋喃的量明显增加,以上结果提示肠系膜静脉血和肠组织中布格呋喃水平的变化可能与ARF大鼠模型中P-糖蛋白功能受到抑制,对底物外排作用减少,肠道吸收增加有关。综上所述,大鼠口服双环醇后主要在肠道发生首过代谢。除溶解度外,肠道CYP3A和P-糖蛋白的联合作用对双环醇/布格呋喃的吸收、代谢和转运影响是导致其口服生物利用度低的主要原因。在肝损伤时,CYP3A活性降低可导致双环醇在肠道和肝脏的代谢发生明显改变,引起口服生物利用度增加;而肾损伤时双环醇在肠道吸收增加是引起其生物利用度增加的主要原因。此外,在病理损伤模型中,可见灌流液,组织匀浆以及肠系膜静脉血中布格呋喃的变化与双环醇增加的趋势一致。双环醇/布格呋喃多次给药对大鼠肝CYP1A2、CYP3A2以及肠mdr1a的mRNA有一定诱导作用。本研究为双环醇/布格呋喃临床应用提供了有价值的实验数据。

论文目录

• 目录
• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 CYP450和P-糖蛋白与双环醇的相互作用
• 一、CYP3A和P-糖蛋白的联合作用对双环醇吸收和代谢的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 方法学评价
• 3.1.1 双环醇测定方法的专属性
• 3.1.2 双环醇测定方法线性
• 3.2 双环醇在in vivo大鼠模型的药代动力学研究
• 3.2.1 大鼠口服/静脉注射双环醇后血浆药代动力学
• 3.2.2 双环醇在肝脏和小肠的首过效应研究
• 3.2.3 大鼠小肠single-pass模型的建立以及双环醇吸收和代谢的研究
• 3.2.4 大鼠肝灌流模型的建立以及双环醇的代谢研究
• 3.3 双环醇在Caco-2细胞模型中的转运研究
• 3.3.1 不同浓度双环醇经Caco-2细胞的转运
• 3.3.2 P-糖蛋白特异性抑制剂对双环醇在Caco-2转运的影响
• 4 讨论
• 二、双环醇对肝脏CYP450和肠道P-糖蛋白的诱导/抑制作用
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 双环醇口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶的诱导作用
• 3.1.1 双环醇口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶活性的影响
• 3.1.2 双环醇口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶mRNA表达的影响
• 3.2 双环醇口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶的体外抑制
• 3.3 双环醇口服给药对UDPGT,GST和GR的诱导作用
• 3.4 双环醇口服给药对大鼠小肠P-糖蛋白的诱导作用
• 4 讨论
• 三、双环醇在病理模型中的药代动力学研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 双环醇在肝损伤状态下的药代动力学研究
• 3.1.1 AHF大鼠肝、肾功能及药物代谢酶的测定
• 3.1.2 AHF大鼠肝微粒体CYP450同工酶活性测定
• 3.1.3 双环醇在AHF大鼠的肝微粒体的代谢速率测定
• 3.1.4 双环醇在AHF大鼠体内药代动力学的研究
• 3.1.5 双环醇在AHF大鼠肝灌流模型的代谢研究
• 3.1.6 双环醇在AHF大鼠肠灌流模型的吸收和代谢研究
• 3.2 双环醇在肾损伤状态下的药代动力学研究
• 3.2.1 ARF大鼠肝、肾功能及药物代谢酶的测定
• 3.2.2 ARF大鼠肝微粒体CYP450同工酶活性的研究
• 3.2.3 双环醇在ARF大鼠肝微粒体的代谢速率测定
• 3.2.4 双环醇在ARF大鼠体内药代动力学的研究
• 3.2.5 双环醇在ARF大鼠肝灌流模型的代谢研究
• 3.2.6 双环醇在ARF大鼠肠灌流模型的吸收和代谢研究
• 4 讨论
• 第二部分 CYP450和P-糖蛋白与布格呋喃的相互作用
• 一、CYP3A和P-糖蛋白的联合作用对布格呋喃吸收和代谢的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 方法学评价
• 3.1.1 布格呋喃测定方法的专属性
• 3.1.2 布格呋喃测定方法线性
• 3.2 布格呋喃在in vivo大鼠模型的药代动力学研究
• 3.2.1 布格呋喃在大鼠小肠single-pass模型的吸收和代谢研究
• 3.2.2 布格呋喃在大鼠肝灌流模型的代谢研究
• 4 讨论
• 二、布格呋喃对肝脏CYP450和小肠P-糖蛋白的诱导作用
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 布格呋喃口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶的诱导作用
• 3.1.1 布格呋喃口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶活性的诱导作用
• 3.1.2 布格呋喃口服给药对大鼠肝脏CYP450同工酶mRNA表达的影响
• 3.2 布格呋喃口服给药对大鼠小肠P-糖蛋白的诱导作用
• 4 讨论
• 三、布格呋喃在病理状态的药代动力学研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 布格呋喃在病理肝损伤状态下的药代动力学研究
• 3.1.1 布格呋喃在AHF大鼠肝微粒体的代谢速率
• 3.1.2 布格呋喃在AHF大鼠肠灌流模型的吸收和代谢研究
• 3.1.3 布格呋喃在AHF大鼠肝灌流模型的代谢研究
• 3.2 布格呋喃在病理肾损伤状态下的药代动力学研究
• 3.2.1 布格呋喃在ARF大鼠肝微粒体的代谢速率测定
• 3.2.2 布格呋喃在ARF大鼠肠灌流模型的吸收和代谢研究
• 3.2.3 布格呋喃在ARF大鼠肝灌流模型的代谢研究
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 附录
• 致谢