论文摘要
骨肉瘤是临床上发病率最高的原发性恶性骨肿瘤,随着外科保肢技术的进步和新辅助化疗方案的应用,此种疾病的治疗已有了显著的进展。在富有经验的骨肿瘤治疗中心,如果单个病变局限在局部,经过保肢手术和术前术后联合化疗,3年无瘤生存率已从10-20%提高到60-70%。但遗憾的是,仍有30%左右的病例出现远隔转移（主要为肺）而死亡。而且这一数据在近二十年中没有大的降低,因此骨肉瘤的肺转移仍是影响患者生存的最主要问题。同其他肿瘤一样,对骨肉瘤转移的治疗首先取决于对这种肿瘤转移机制的认识。经过几十年的研究,特别是后基因组时代高通量的研究工具如生物芯片,蛋白质组学,质谱技术以及生物信息学的迅猛发展使整个肿瘤学的研究包括肿瘤转移研究进入整体系统水平,关于肿瘤转移的基本框架也已经完成,许多在肿瘤转移过程中发挥重要作用的分子被相继鉴定出来。分子机制的阐明产生了许多针对性的诊断和治疗方法,如分子成像,基因治疗,分子靶向治疗等。但由于骨肉瘤的发病率比常见的肺癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤低得多,尚缺乏特异性和系统性的研究。尤其是在骨肉瘤发生肺转移的过程中,究竟哪些分子参与其中呢?本课题将对此进行探讨。【目的】:筛选人骨肉瘤肺转移相关的分子并初步验证【方法】:1.利用原位移植技术和体内连续筛选建立不同转移潜能的骨肉瘤亚系2.利用MTT,细胞黏附实验,侵袭实验,克隆形成实验,钙结节形成实验,肿瘤血管形成实验,凋亡检测,细胞骨架蛋白染色等检测细胞亚系的生物学性质3.利用人类全基因组芯片进行差异基因的筛选4.利用人类MicroRNA芯片进行差异MicroRNA的筛选5.通过双向电泳结合质谱分析进行差异蛋白的筛选6.利用软件进行生物信息学分析,确定候选分子7.利用实时荧光定量PCR,Western Blot,免疫组织化学染色进行初步功能验证。【结果】1.建立了具有高转移潜能的骨肉瘤细胞亚系SOSP-9607F5M2（下称F5M2）,自发转移率达到100%,及低转移潜能的细胞亚系SOSP-9607F4 （下称F4）,自发转移率保持在30%左右;筛选出高转移潜能的骨肉瘤亚系Saos-2M2,自发转移率达到90%。这两对细胞株（F5M2 vs F4,Saos-2M2 vs Saos-2）来源相同,转移潜能不同,可以作为差异表达研究的细胞模型。2.不同转移潜能的细胞株具有不同的生物学性质我们对不同转移潜能的骨肉瘤细胞株F5M2/F4进行了与转移相关的生物学性质研究发现这两株细胞株在增殖,抗凋亡,侵袭能力方面差异显著,而在肿瘤血管形成,异质黏附,细胞骨架和运动能力,成骨潜能方面没有明显差异。3.不同转移潜能骨肉瘤细胞株的基因表达谱分析我们利用人类全基因组芯片对F5M2/F4的基因表达谱进行了差异表达分析。共有484个基因差异表达在2倍以上,上调277个,下调207个。4.不同转移潜能骨肉瘤细胞株的MicroRNA芯片分析我们利用MicroRNA芯片对F5M2/F4的的MicroRNA进行了差异表达分析。共有76个MicroRNA分子差异表达,其中上调43个,下调33个。5.不同转移潜能的骨肉瘤细胞株的差异蛋白分析我们利用双向荧光凝胶电泳结合质谱分析对F5M2/F4的差异表达蛋白进行了分析。共鉴定出1.2倍以上差异表达的蛋白点37个,其中上调24个,下调13个。6.表达谱数据的生物信息学分析我们利用软件Genespring,生物芯片在线分析系统SAS对以上的数据进行了生物信息学的分析,确定了EREG、CHST2、ALDOA、SULT1A3、等四个分子为候选转移相关分子。7.生物芯片和蛋白质组学的验证我们利用qRT-PCR对9个差异表达基因进行了验证,均获得了与芯片表达趋势一致的结果;利用qRT-PCR对6个差异MicroRNA分子进行了验证,5个获得了一致的结果,miR145的检测结果与芯片预测的相反;我们利用Western Blot检测了ALDOA,SULT1A3在F5M2/F4中的蛋白表达水平,证实这两种蛋白确实存在与蛋白质组学研究趋势一致的差异表达。8.候选分子的初步功能验证我们利用Western Blot检测了6种骨肉瘤细胞系/亚系中EREG,CHST2,ALDOA,SULT1A3的表达发现这四个分子在人骨肉瘤细胞系中均有表达;利用免疫组化方法检测了EREG、CHST2、ALDOA、SULT1A3在骨肉瘤患者石蜡切片中的表达,发现这四个分子在预后不同的骨肉瘤患者中阳性率差异明显;这些结果均初步证明EREG、CHST2、ALDOA、SULT1A3在骨肉瘤肺转移过程中发挥了重要作用。【结论】我们建立了不同转移潜能的人骨肉瘤细胞株,利用基因芯片,MicroRNA芯片。差异蛋白质组学技术对其差异表达的分子进行了筛选,通过生物信息学分析,确定了EREG,CHST2,ALDOA,SULT1A3等四个分子为人骨肉瘤肺转移相关分子并得到了初步验证。
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