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中国健康志愿者多药耐药基因和细胞色素酶3A4/5的基因多态性及CYP3A表型和他克莫司代谢相关性研究

2020-12-07阅读(741)

中国健康志愿者多药耐药基因和细胞色素酶3A4/5的基因多态性及CYP3A表型和他克莫司代谢相关性研究

论文摘要

目的考察中国健康志愿者中MDR1, CYP3A4*18B和CYP3A5*3的基因多态性与他克莫司药动学的关系,以及用咪达唑仑分析CYP3A表型来预测他克莫司清除率的方法的有效性。方法药动学的数据来自于一个口服他克莫司的生物等效性比较试验（n=22）。受试者给予他克莫司5mg,给药前和给药后72小时内取全血16次,获得完整药时曲线。连续20天的观察期后给予7.5mg咪达唑仑,给药后4小时收集血浆。直接测序法测定每名受试者MDR1 C1236T,G2677T/A,C3435T,CYP3A4*18B和CYP3A5*3的单核苷酸基因多态性（SNP）。液相串联质谱法（LC-MS/MS法）测定他克莫司以及咪达唑仑原药和其羟基化代谢产物的浓度。用单因素方差分析（ANOVA）的非房室模型和非线性混合效应模型（NONMEM）分析其药动学和上述SNPs的关系。采用Spearman法对他克莫司的清除率和咪达唑仑、1’-羟基化咪达唑仑的血浆浓度,以及1’-羟基化咪达唑仑／咪达唑仑的比值之间的关系进行了分析。结果1.CYP3A4*18B SNP:CYP3A4*1/*1（n=15）基因型的受试者与CYP3A4*1/*18B（n=6）或CYP3A4*18B/*18B（n=1）基因型的受试者间峰浓度（Cmax,P=0.004）和药时曲线下面积（AUCinf,P=0.005）存在显著差异。CYP3A4*1/*1野生基因型的受试者（n=15）的他克莫司Cmax和AUCinf的几何均值分别为CYP3A4*18B等位基因的受试者（n=7）的1.8倍和1.9倍。2.CYP3A5*3 SNP:CYP3A5*1/*3（n=9）基因型的受试者与CYP3A5*3/*3（n=13）基因型的受试者间AUCinf（P=0.001）存在显著差异,未见Cmax（P=0.062）存在差异。CYP3A5*3/*3基因型受试者的他克莫司的AUCinf的几何均值为CYP3A5*1/*3基因型的受试者的2.0倍。3.CYP3A4*18B和CYP3A5*3联合基因的作用强于CYP3A4*18B和CYP3A5*3单独的作用。非线性混合效应模型显示联合基因的作用占表观清除率个体差异的28.4%,与非群体方法得到的结果一致。CYP3A4*1/*1-CYP3A5*3/*3（n=11）携带者（n=11）与非携带者（n=11）的Cmax（P=0.030）和AUCinf（P<0.001）存在显著差异。CYP3A4*1/*1-CYP3A5*3/*3 （n=11）携带者的Cmax和AUCinf的几何均值分别为非携带者（n=11）的1.6倍和2.1倍。4.对于MDR1 SNPs及单倍体,未见其对他克莫司药动学的影响。咪达唑仑的实验表明用咪达唑仑对CYP3A表型分型不适用于体内预测他克莫司药动学。结论本研究表明CYP3A4*18B和CYP3A5*3的基因多态性均能影响他克莫司的体内药动学,CYP3A4*1/*1-CYP3A5*3/*3联合基因型的受试者服用较低剂量的他克莫司即可达到相同靶浓度。本项研究同时表明来自于C1236T,G2677A/T和C3435T的MDR1基因型/单倍体/连接基因型对他克莫司的药动学没有影响,用咪达唑仑作CYP3A表型分析也不适用于预测他克莫司的剂量需求。

论文目录

  • 缩写字母表
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 第一部分 中国健康志愿者单次口服他克莫司的药物动力学研究
  • 1 引言
  • 2 实验仪器、药品和试剂
  • 2.1 主要化学品
  • 2.2 仪器和消耗品
  • 3 方法
  • 3.1 人体试验方法
  • 3.1.1 受试者选择
  • 3.1.2 研究设计与血样采集
  • 3.2 他克莫司LC-MS/MS测定方法
  • 3.2.1 色谱条件
  • 3.2.2 质谱条件
  • 3.2.3 全血样品的处理
  • 3.2.4 标准曲线
  • 3.2.5 准确度和精密度
  • 3.2.6 提取回收率
  • 3.2.7 稳定性
  • 3.2.8 介质效应
  • 4 结果
  • 4.1 人体试验
  • 4.2 他克莫司分析方法验证
  • 4.2.1 专一性
  • 4.2.2 线性范围
  • 4.2.3 最低定量限（LLOQ）
  • 4.2.4 准确度和精密度
  • 4.2.5 提取回收率
  • 4.2.6 稳定性
  • 4.2.7 介质效应
  • 4.3 志愿者血药浓度测定
  • 4.4 药物动力学参数
  • 5 讨论
  • 6 结论
  • 7 附图
  • 图1-1 他克莫司化学结构图
  • 图1-2 空白人全血的色谱图
  • 图1-3 他克莫司在人全血中的标准曲线（1/X加权）
  • 图1-4 他克莫司的最低定量限（LLOQ）色谱图
  • 图1-5 22名志愿者口服5mg普乐可复后平均药时曲线图
  • 8 附表
  • 表1-1 受试者一般资料
  • 表1-2 验证试验（3批次）标准曲线结果
  • 表1-3 批内（RUN1）精密度（Precision）和准确度（Bias）
  • 表1-4 批间（RUN1～RUN3）精密度（Precision）和准确度（Bias）
  • 表1-5 他克莫司和IS提取回收率
  • 表1-6 提取后的样品放置于自动进样器中的稳定性
  • 表1-7 质控样品经3次冻融试验的稳定性
  • 表1-8 他克莫司和IS介质效应
  • 表1-9 22名志愿者口服5mg普乐可复胶囊后72小时经时曲线浓度（ng/mL）
  • 表1-10 22名志愿者口服5mg普乐可复胶囊后主要药物动力学参数
  • 第二部分 中国健康志愿者MDR1,CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因和CYP3A表型研究
  • 1 引言
  • 2 实验仪器与试剂
  • 2.1 仪器
  • 2.2 试剂
  • 3 方法
  • 3.1 基因测序方法
  • 3.1.1 DNA抽提
  • 3.1.2 PCR扩增
  • 3.1.3 PCR产物纯化
  • 3.1.4 PCR产物测序
  • 3.1.5 统计分析
  • 3.2 CYP3A表型分型LC-MS/MS测定咪达唑仑和1’-羟基咪达唑仑方法
  • 3.2.1 溶液配制
  • 3.2.2 色谱条件
  • 3.2.3 血浆样品前处理
  • 3.2.4 质谱条件
  • 3.2.5 线性
  • 4 结果
  • 4.1 基因测序结果
  • 4.2 咪达唑仑和1-羟基咪达唑仑浓度测定结果
  • 5 讨论
  • 6 结论
  • 7 附表
  • 表2-1 MDR1,CYP3A4和CYP3A5的单核酸多态性基因分型的引物序列
  • 表2-2 基因检测样品反应体系
  • 表2-3 PCR循环条件
  • 表2-4 咪哒唑仑和1’-羟基-咪哒唑仑一系列标准血浆储备样本的制备
  • 表2-5 LC-MS/MS检测条件
  • 表2-6 22名健康志愿者MDR1等位基因和CYP3A4*18B,CYP3A5*3基因类型
  • 表2-7 22名健康志愿者CYP3A4*18B,CYP3A5*3和MDR1等位基因和基因型频率
  • 表2-8 21名健康志愿者口服咪哒唑仑4小时后血浆1’-羟基咪哒唑仑、咪哒唑仑浓度及比值
  • 第三部分 中国健康志愿者的MDR1,CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因多态性和咪达唑仑的CYP3A表型分析与他克莫司药动学相关性研究
  • 1 引言
  • 2 实验材料
  • 3 方法
  • 3.1 非房室模型
  • 3.1.1 非房室药动学参数计算
  • 3.1.2 他克莫司药动学参数和咪达唑仑浓度之间的关系
  • 3.2 非线性多效模型
  • 3.2.1 数据分析程序
  • 3.2.2 基本模型
  • 3.2.3 统计学模型
  • 3.2.4 协变量筛选
  • 3.2.5 模型评价标准
  • 3.2.6 药动学参数计算
  • 3.2.7 模型评估
  • 4 结果
  • 4.1 非房室模型结果
  • 4.1.1 CYP3A4,CYP3A5和MDR1 SNPs的作用
  • 4.1.2 MDR1单倍体/连接基因型和CYP3A4/5联合基因型的作用
  • 4.1.3 CYP3A表型探针咪达唑仑与他克莫司清除率之间的关系
  • 4.2 非线性多效模型
  • 5 讨论
  • 6 结论
  • 7 附图
  • inf的相关性'>图3-1 22名志愿者CYP3A4*18B,CYP3A5*3,CYP3A4*18B-CYP3A5*3联合基因型与他克莫司AUCinf的相关性
  • 图3-2 基本拟合优度图
  • 图3-3 他克莫司全血浓度观测值及模型对CYP3A4*1/*1-CYP3A5*3/*3携带者（右图）和非携带者（左图）90%区间预测
  • 图3-4 100次模拟研究群体中CYP3A4*18B,CYP3A5*3和CYP3A4*18B-CYP3A5*3不同基因型他克莫司暴露频率分布
  • 8 附表
  • 表3-1 22名健康志愿者MDR1单核酸多态性,CYP3A4,CYP3A5,CYP3A4*18B-CYP3A5*3联合基因型和他克莫司药动学参数相关牲
  • 表3-2 21名健康志愿者服咪哒唑仑4小时血浆1’-羟基咪哒唑仑、咪哒唑仑浓度及其比值与CYP3A基因型关系
  • 表3-3 采用Spearman相关系数法分析21名健康志愿者服咪哒唑仑4小时血浆1’-羟基咪哒唑仑、咪哒唑仑浓度及其比值与他克莫司清除率关系
  • 表3-4 他克莫司群体药动学参数在所有数据集和五个不同子集估计（交叉验证）
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

    • 相关论文文献

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