油菜根系响应低硼胁迫的差异蛋白与功能分析

论文摘要

硼是维持植物生长发育所必需的微量元素之一,缺硼不仅会导致作物减产,其品质也受到影响。甘蓝型油菜对硼的需求量大,对缺硼敏感。在我国,油菜主要种植区是缺硼比较严重的地区,土壤有效硼缺乏是限制油菜增产的重要因素。施用硼肥是目前生产中广泛采用的解决办法,但是这不仅增加了成本还有可能造成环境污染。因此,通过筛选硼高效品种,解析其适应低硼的生理和遗传机理,进而改良油菜营养遗传性状,对维持我国油菜产业可持续发展具有重要意义。在实验室已有的工作基础上,本研究采用差异蛋白质组学技术,获得了硼高效品种青油10号在不同程度硼缺乏情况下的蛋白表达谱,整合分析了根系响应低硼胁迫的代谢途径网络,提出了该材料适应低硼环境的可能机制。主要的研究结果如下：1甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取及双向电泳体系的优化。采用三氯乙酸／丙酮沉淀法、酚提法、酚提取-甲醇／醋酸钱沉淀法分别提取甘蓝型油菜根系可溶性蛋白,对比分析聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及双向电泳（2-DE）的检测效果,最终选择优化的酚提法,并对提取步骤、双向电泳上样量和凝胶浓度进行调整,优化了实验技术体系。2低硼诱导差异表达蛋白的分离和质谱鉴定。短期低硼胁迫处理油菜幼苗,取不同时间点根系为材料提取蛋白,通过双向电泳进行分离,使用分析软件PDquest对比实验组和对照组图像找到78个差异点,经MALDI-TOF/TOF质谱分析鉴定了46个蛋白。3差异蛋白代谢途径的整合及功能分析。运用InterPro, NCBI, UniProt, TAIR等生物信息学分析软件和公共数据库,系统分析了所有差异蛋白的生理生化功能、表达部位和模式、代谢途径等信息,将这些低硼响应蛋白分为碳水化合物与能量代谢,逆境响应蛋白,信号转导与调控,蛋白相关进程,氨基酸与脂肪酸代谢,核酸代谢,细胞壁结构以及其他等八类。4青油10号低硼适应机制的分析。糖代谢可能是低硼胁迫下各生理事件的一个调控中枢,糖类物质向不同代谢途径的流动维持了能量代谢及存储和还原力供给之间的平衡。在低硼胁迫程度较轻时,MAPK信号系统启动但能量代谢未受影响。胁迫加重后植物细胞内稳态被打破,青油10号通过降低能量代谢率来减少氧自由基产生,多种信号通路活跃,各种抗氧化酶被诱导上调表达,从而重建氧化还原平衡。同时植物细胞受硼缺乏限制营养和能量供给受到影响,许多生物活性物质合成及代谢途径仅维持本底水平以延长存活时间。此外,参与或调节细胞壁合成与稳定性的相关基因被诱导表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 植物硼生理与遗传研究进展
• 1.1.1 硼在植物中的生理功能
• 1.1.2 植物对硼的吸收和转运
• 1.1.3 甘蓝型油菜硼高效遗传机理研究
• 1.2 蛋白质组学在植物研究中的应用
• 1.2.1 蛋白质组学的出现与发展
• 1.2.2 蛋白质组学主要研究技术
• 1.2.3 植物蛋白质组研究现状
• 1.3 研究背景、内容和技术路线
• 1.3.1 研究背景
• 1.3.2 研究内容
• 1.3.3 技术路线
• 2 甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取及双向电泳体系的优化
• 2.1 试验材料培养
• 2.2 油菜根系蛋白质提取方法
• 2.2.1 三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法
• 2.2.2 酚提法
• 2.2.3 酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法
• 2.3 蛋白质定量与单向检测
• 2.3.1 蛋白溶解定量
• 2.3.2 SDS-PAGE单向检测
• 2.4 蛋白质双向电泳
• 2.4.1 第一向等电聚焦（IEF）
• 2.4.2 第二向SDS-PAGE
• 2.4.3 凝胶染色与扫描
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 三种提取方法蛋白提取率的对比分析
• 2.5.2 SDS-PAGE单向检测蛋白质量
• 2.5.3 三组蛋白的2-DE分析
• 2.5.4 双向电泳体系的优化
• 2.6 讨论
• 2.6.1 油菜根系蛋白质样品制备
• 2.6.2 双向电泳技术体系的优化
• 3 短期硼胁迫下油菜根系差异蛋白的分离与鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与蛋白制备
• 3.1.2 蛋白质双向凝胶电泳分离
• 3.1.3 凝胶图像分析
• 3.1.4 挖点与酶解
• 3.1.5 蛋白质谱分析与数据库检索
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 缺硼处理下植株的生长状况和生物量调查
• 3.2.2 双向电泳图像分析
• 3.2.3 差异表达蛋白质谱鉴定
• 3.3 讨论
• 4 短期硼胁迫下油菜根系差异表达蛋白的功能分析
• 4.1 差异表达蛋白的功能聚类
• 4.2 差异表达蛋白的功能分析
• 4.2.1 碳水化合物与能量代谢
• 4.2.2 抗逆相关蛋白
• 4.2.3 信号与调控蛋白
• 4.2.4 细胞壁结构
• 4.2.5 蛋白质合成与降解
• 4.2.6 氨基酸与脂肪酸代谢
• 4.2.7 核酸代谢
• 4.3 讨论
• 5 差异表达蛋白的基因表达分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料培养
• 5.1.2 RNA提取与逆转录
• 5.1.3 引物设计与检验
• 5.1.4 实时定量PCR反应和数据处理
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 6 抗氧化能力的生理验证
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料培养
• 6.1.2 丙二醛含量测定
• 6.1.3 谷胱甘肽还原酶活性测定
• 6.2 结果与分析
• 6.3 讨论
• 7 总结和展望
• 7.1 油菜根系蛋白双向电泳技术体系的优化
• 7.2 油菜根系在短期硼胁下差异蛋白谱的构建
• 7.3 青油10号低硼适应机制的解析
• 7.4 本研究的创新与不足之处
• 7.5 硼高效机制研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附表1
• 附表2
• 附表3
• 发表文章