论文摘要
天然萜类化合物广泛应用于医疗保健和美容化妆等领域,特别是很多二萜类化合物来源的药物可用于治疗癌症和心脑血管等疾病。从天然原料中直接提取或化学全合成萜类化合物存在生产效率低,成本高及环境污染严重等系列问题,而代谢工程的发展为实现微生物发酵生产外源药用萜类成分提供了一种新方式。本研究运用代谢工程的相关思路和方法,选择二萜类化合物次丹参酮二烯和番茄红素作为研究对象,利用酿酒酵母自身的MVA途径,通过分别引入外源的丹参SmCPS, SmKSL基因和成团泛菌的CrtB、CrtI基因,在酵母体内构建出次丹参酮二烯和番茄红素的生物合成途径,实现利用酿酒酵母人工细胞工厂来生产二萜类物质：次丹参酮二烯产量达4.2 mg/L、番茄红素产量达0.69 mg/L。为了进一步提高细胞合成次丹参酮二烯的能力,萜类合成途径中的HMG1, ERG20-BTS1和SaGGPSSyn,及与萜类相关的转录因子UPC2基因被系统优化。结果表明：由tHMG1和突变UPC2.1组成的功能模块tHMG1-UPC2.1能显著增加工程菌中基本萜类的供应（鲨烯产量达78mg/L）;融合基因ERG20-BTS1和来自嗜酸热硫化叶菌的SaGGPSsyn组成的功能模块ERG20/BTSl-SaGGPSSyn能改善工程菌中GGPP的供应,将次丹参酮二烯产量提高到8.8 mg/L。为了使菌株能够在丰富培养基上生长,质粒上的营养缺陷型筛选标记被抗生素基因替换,并对两个功能模块进行组合调控。结果发现低拷贝的功能模块HMG1-UPC2.1和高拷贝的ERG20/BTS1-SaGGPS Syn协同表达进一步提高产量,次丹参酮二烯达到61.8 mg/L。为了验证功能模块组合调控的作用,在番茄红素工程菌中进行验证,结果发现在番茄红素酵母菌中,低拷贝的功能模块HMG1-UPC2.1和低拷贝的ERG20/BTS1-SaGGPS Syn协同表达效果最好,产量达8.49 mg/L。最终经过高密度发酵,次丹参酮二烯产量达到了488 mg/L,鲨烯产量为852mg/L,番茄红素为21.17 mg/L本研究通过合理搭配显著提高了人工酵母细胞合成二萜及三萜化合物的能力,并且为微生物发酵法取代植物提取药用萜类化合物提供了基础。