论文摘要
随着自由基理论的建立和发展，人们发现氧的某些代谢产物及其衍生的活性物质可以损伤机体，这些物质具有比氧更为活泼的化学性质，统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS）。正常情况下，ROS的产生和清除保持动态平衡，但是在某些病理情况下和衰老时，ROS产生增加或细胞抗氧化机制受损，可造成ROS的累积，主要导致大分子物质如脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），脂质和蛋白质的氧化损伤。DNA的氧化损伤可以导致核DNA和线粒体DNA突变或缺失，细胞膜脂质过氧化导致膜流动性改变，而蛋白的氧化损伤导致重要酶失活，蛋白功能受损。研究发现卵泡液中存在ROS，一定水平的ROS对维持卵母细胞的正常生长发挥重要作用，ROS的过度升高对卵母细胞成熟和后续胚胎发育造成不良影响。研究还发现氧化应激参与胚胎发育缺陷的发生，第一天胚胎培养液中高水平的ROS对胚胎发育产生不良影响。精子冷冻和热应激状态会导致ROS水平显著升高。这些结果提示了人卵泡液、胚胎培养液和低温冷冻精液中存在ROS所致的氧化应激现象。以往的研究，主要关注ROS介导的脂质过氧化损伤，但近年的研究说明，蛋白质的氧化修饰不容忽视。但是目前为止，关于在人卵泡液、胚胎培养液和低温冷冻精液中ROS介导的蛋白氧化损伤的研究还未见报道，那么上述系统是否存在蛋白氧化应激现象?其程度是否会造成不良影响?本研究拟在ROS在生殖方面的研究和蛋白氧化在人类其它组织研究的基础上，以晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products，AOPP）为蛋白氧化损伤的指标，观察人卵泡液、胚胎培养液和低温冷冻精液中是否存在ROS介导的蛋白氧化损伤，并初步探讨其与卵母细胞和早期胚胎发育的关系。第一章人卵泡液中蛋白氧化水平与IVF-ET结局参数的关系【目的】探讨体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET）周期卵泡液中蛋白氧化水平与IVF-ET结局参数的关系。【方法】1．标本来源和分组：卵泡液标本来自南方医院生殖中心2005年7月至2006年4月之间接受IVF-ET治疗的64例不孕症女性患者。病例选择标准：年龄在25～38岁，平均年龄32.41±3.17岁；单纯输卵管性因素不孕；行常规IVF-ET治疗；HCG日子宫内膜在8.0 mm以上，并且无内膜病变。根据获卵数分为三组，获卵数＜8个组16例，获卵数8～15个组32例，获卵数＞15个组16例。根据患者年龄分为三组，年龄＜30岁组11例，30岁～35岁组41例，＞35岁组12例。2．实验方法：以AOPP作为蛋白氧化指标，采用Vitko-Sarsat等介绍的方法进行测定。3．统计学方法：所有数据应用spss10.0统计软件进行分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。结果以均数±标准差（（?）±s）或百分率（％）表示，采用偏相关分析、One-way ANOVA方差分析和独立样本t检验。【结果】1．卵泡液中AOPP水平与成熟卵母细胞比例（r=-0.401，P=0.001）、受精率（r=-0.257，P=0.045）、卵裂率（r=-0.290，P=0.024）、良好胚胎形成率（r=-0.520，P=0.000）均呈显著负相关。2．不同获卵数组之间AOPP水平有显著性差异（F=3.851，P=0.027），其中以获卵数8～15个组AOPP水平最低，获卵数＜8个组最高。3．非妊娠组AOPP水平高于妊娠组，有显著性差异（t=3.665，P=-0.001）。4．不同年龄组AOPP水平差异有显著性意义（F=15.919，P=0.000），其中年龄＞35岁组AOPP水平最高，＜30岁组最低。【结论】1．IVF-ET周期中，卵泡液中存在蛋白氧化应激现象。2．卵泡液中高水平的AOPP可能对卵母细胞和早期胚胎发育造成不良影响，继而影响IVF结局。第二章第一天胚胎培养液中蛋白氧化水平与早期胚胎发育的关系【目的】探讨IVF-ET周期第一天胚胎培养液中蛋白氧化水平与早期胚胎发育的关系。【方法】1．标本来源和分组：第一天胚胎培养液标本来自南方医院生殖中心2005年7月至11月之间进行常规IVF治疗的30例患者和单精子卵细胞内注射（intracytoplasmic sperm injection-embryo transplantation，ICSI-ET）治疗的30例患者。分组：根据受精类型分为两组，常规IVF组30例和ICSI组30例。根据不孕妇女年龄分组，常规IVF组30例中年龄＜30岁组4例，30岁～35岁组17例，＞35岁组9例；ICSI组30例中年龄＜30岁组8例，30岁～35岁组18例，＞35岁组4例。2．实验方法：以AOPP作为蛋白氧化指标，采用Vitko-Sarsat等介绍的方法进行测定。3．统计学方法：所有数据应用spss10.0统计软件进行分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。结果以均数±标准差（（?）±s）表示，采用偏相关分析，独立样本t检验和One-way ANOVA方差分析。【结果】1．常规IVF周期中，第一天胚胎培养液中AOPP浓度在3.2μmol／l以下时，其变化与受精率（r=0.137，P=0.863）、卵裂率（r=0.623，P=0.377）、碎片10％以下胚胎形成率（r=-0.156，P=0.844）、六细胞以上胚胎形成率（r=-0.444，P=0.556）无相关性；在3.2μmol／l以上时，AOPP水平与受精率（r=-0.226，P=0.338）、卵裂率（r=0.202，P=0.392）、碎片10％以下胚胎形成率（r=-0.232，P=0.325）、六细胞以上胚胎形成率（r=0.008，P=0.975）亦无相关性。2．ICSI周期中，第一天胚胎培养液中AOPP浓度在3.2μmol／l以下时，其变化与受精率（r=-0.323，P=0.791）、卵裂率（r=0.014，P=0.991）、碎片10％以下胚胎形成率（r=0.238，P=0.847）、六细胞以上胚胎形成率（r=-0.029，P=0.982）无相关性；在3.2μmol／l以上时，AOPP水平与受精率（r=-0.472，P=0.031）、碎片10％以下胚胎形成率（r=-0.482，P=0.027）、六细胞以上胚胎形成率（r=-0.548，P=0.010）呈显著负相关，与卵裂率（r=-0.096，P=0.679）无相关性。3．常规IVF周期中，非妊娠组中AOPP水平高于妊娠组，有显著性差异（t=3.160，P=0.004）；不同年龄组AOPP水平有显著性差异（F=19.395，P=0.000），其中不孕妇女年龄＞35岁组AOPP水平最高，＜30岁组最低。4．ICSI周期中，非妊娠组AOPP水平高于妊娠组，有显著性差异（t=2.421，P=0.022）；不同年龄组AOPP水平有显著性差异（F=3.975，P=0.031），其中不孕妇女年龄＞35岁组AOPP水平最高，＜30岁组最低。【结论】1．IVF-ET周期中，第一天胚胎培养液中存在蛋白氧化应激现象。2．ICSI周期中，第一天胚胎培养液中高水平的AOPP可能对早期胚胎发育和IVF结局造成不良影响。3．常规IVF周期中，第一天胚胎培养液中高水平的AOPP虽然不影响早期胚胎发育，但对IVF结局造成不良影响。第三章低温冷冻和孵育对人精子氧化应激水平的影响【目的】探讨低温冷冻和孵育对人精子氧化应激水平的影响。【方法】1．标本来源和分组：60例正常人精液标本取自南方医院生殖医学中心因女性因素行试管婴儿治疗的男性患者。将每一例精液标本，梯度离心法处理后，取得沉淀之精子，加人输卵管培养液（human tubal fluid，HTF），配制成精子密度在（20～30）×106／mL的悬液，取2.5 mL均分五份，分为五组，分别进行以下处理：A组为处理前对照组，不进行低温冷冻处理或孵育处理。B组为低温冷冻空白实验组，去除精子后的精子悬液进行低温冷冻处理。C组为低温冷冻样本组，含精子的精子悬液进行低温冷冻处理。D组为孵育空白实验组，去除精子后的精子悬液进行孵育处理。E组为孵育样本组，含精子的精子悬液进行孵育处理。2．实验方法：以AOPP作为蛋白氧化指标，采用Vitko-Sarsat等介绍的方法进行测定。以丙二醛（malondialdehyde，MDA）作为脂质过氧化指标，采用硫代巴比妥酸（thiobarbituri，TBA）比色法。3．统计学方法：所有数据以均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS10.0统计软件进行分析，P＜0.05为差异显著。采用One-way ANOVA方差分析，AOPP水平的多重比较采用Tamhane’s T2方法，MDA水平的多重比较采用最小有意义差异（least significant difference，LSD）t检验方法。【结果】1．不同处理组之间AOPP水平（F=19.994，P=0.000）和MDA水平（F=31.837，P=0.000）均有显著性差异。2．低温冷冻样本组MDA水平显著高于处理前对照组（P=0.000）和低温冷冻空白实验组（P=0.000），但AOPP水平无显著性差异（P1=0.663；P2=0.829）。3．孵育样本组AOPP和MDA水平均显著高于处理前对照组和孵育空白实验组（AOPP：P1=0.000；P2=0.000。MDA：P1=0.000；P2=0.000）。4．孵育样本组与低温冷冻样本组比较，AOPP（P=0.000）和MDA（P=0.046）水平均显著升高。【结论】1．精子的低温冷冻和孵育，均存在氧化应激损伤。2．低温冷冻主要造成精子的脂质过氧化损伤，孵育可致精子的脂质过氧化损伤和蛋白氧化损伤。
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