利用SB转座系统进行LacZ/H2-K～b基因转座研究

论文摘要

目的SB转座子系统具有将外源基因转座导入小鼠成体细胞基因组，并介导其在体内长期稳定表达的能力，因此SB转座系统作为一种非病毒载体在基因治疗领域发挥重要作用。本实验运用SB转座子系统进行报告基因LacZ以及RIP启动子携带的Ⅰ型糖尿病相关基因H2-Kb的基因转座研究。通过在细胞及整体水平上利用SB转座系统进行基因转座的实验，以建立转座系统应用的工作平台，为以后进行大片段DNA转基因研究打下基础。方法对成年鼠尾静脉注射使用DOTAP：CHOL包裹的携带目的基因的SB转座子与SB转座酶两种质粒DNA，通过LacZ染色、组织病理切片H／E染色、PCR、RT、Slot Bloting以及体重、血糖、尿糖的检测手段鉴定实验结果。结果通过各种实验手段分析，转座子转入LacZ基因的小鼠验证了该报告基因的表达；转座子转入胰腺特异性表达的RIP启动子携带H2-Kb基因的小鼠实验中，小鼠胰腺出现了胰腺β细胞团衰退减少、体重下降、血糖升高等病理改变。结论本实验通过对成年鼠尾静脉注射携带目的基因的转座子与转座酶以达到成体细胞转基因目的，验证了转座平台的运作。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 专业名词缩写中英文对照表
• 前言
• 实验技术路线图
• （一） 材料与方法
• 1.pT2BH-LacZ的构建
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 大肠杆菌感受态的制备
• 1.4 酶切
• 1.5 切胶回收转座子载体片段与CMV-LacZ片段
• 1.6 连接
• 1.7 转化抽提
• 1.8 质粒的抽提
• 1.9 酶切检验
• b的构建'>2.pT2BH-H2-K^b的构建
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 大肠杆菌感受态的制备
• 2.4 酶切
• b片段'>2.5 切胶回收转座子载体片段与RIP-H2-K^b片段
• 2.6 连接
• 2.7 转化抽提
• 2.8 质粒的抽提
• 2.9 酶切检验
• 3.细胞转染
• 3.1 材料和试剂
• 3.2 主要仪器
• 3.3 主要试剂的配制
• 3.4 细胞株的解冻
• 3.5 细胞传代
• 3.6 细胞计数
• 3.7 细胞株的冻存
• 3.8 细胞转染
• 4.尾静脉注射
• 4.1 材料和试剂
• 4.2 主要仪器
• 4.3 注射试剂的配制
• 4.4 注射方法
• 5.LacZ染色方法
• 5.1 材料和试剂
• 5.2 主要仪器
• 5.3 主要试剂的配制
• 5.4 细胞染色步骤
• 5.5 组织染色步骤
• 6.注射pT2BH-LacZ后阳性小鼠的检测
• 6.1 材料和试剂
• 6.2 主要仪器
• 6.3 组织切片
• 6.4 鼠尾gDNA的抽提
• 6.5 H/E染色
• b后阳性小鼠的检测'>7.注射pT2BH-H2-K^b后阳性小鼠的检测
• 7.1 材料和试剂
• 7.2 主要仪器
• 7.3 血糖检测
• 7.4 尿糖检测
• 7.5 眼眶静脉丛取血
• 7.6 血胰岛素的检测
• 7.7鼠尾gDNA的抽提
• 7.8 PCR筛选
• 7.9 脉冲场电泳
• 7.10 狭缝杂交
• 7.11 组织病理切片
• 7.12 组织RNA的抽提
• 7.13 RNA的逆转录
• （二） 实验结果
• 1 SB转座系统质粒的扩增
• 1.1 pT2BH与pT2HB质粒酶切结果
• 1.2 pCMV-SB10与pCMV-SB11质粒酶切结果
• 2 pT2BH-LacZ质粒构建结果
• 2.1 测序结果
• 2.2 酶切检验结果
• b质粒构建结果'>3 pT2BH-H2-K^b质粒构建结果
• 3.1 测序结果
• 3.2 酶切检验结果
• 4 pT2BH-LacZ质粒细胞转染结果
• 4.1 pT2BH-LacZ质粒转染HELA细胞结果
• 4.2 pT2BH-LacZ质粒转染MCF-7细胞结果
• 5 pT2BH-LacZ质粒显微注射结果
• 5.1 染色结果
• 6 pT2BH-LacZ质粒鼠尾静脉注射结果
• 6.1 染色结果
• b质粒鼠尾静脉注射结果'>7 pT2BH-H2-K^b质粒鼠尾静脉注射结果
• 7.1 体重监测结果
• 7.2 血糖监测结果
• 7.3 尿糖检测结果
• 7.4 血胰岛素检测结果
• 7.5 PCR检测结果
• 7.6 Slot Bloting结果
• 7.7 组织病理切片结果
• （三） 讨论
• （四） 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历