论文摘要
Ⅰ型糖尿病是目前严重危害人类健康的常见病、多发病，全世界约有2％-5％的人患有此种疾病，且呈逐年增长趋势，多见于儿童和青少年。从降糖药物到胰岛素，从胰腺移植到胰岛移植，Ⅰ型糖尿病的治疗经历了一个漫长的过程。而目前微囊化胰岛移植是糖尿病治疗的研究热点。由于微囊化技术的应用，在很大程度上解决了移植过程中的免疫排斥问题。然而小分子的炎症因子仍然能够透过微囊对移植物造成损害，最终导致胰岛死亡。IL-10是一种35～40kD的酸性蛋白，由两个同源的亚基组成．它具有抗炎和抑制多种细胞因子合成的作用，所以称之为细胞因子合成抑制因子（Cytokine Synthesis Inhibiting Factor，CSIF）。目前很多实验证明IL-10具有抗炎症活性和免疫抑制活性，为一种潜在的免疫增殖反应和炎症反应的负性调节因子，是针对器官移植的良性细胞因子。基于上述原因，本研究通过构建稳定表达hIL-10的基因工程细胞株并将其微囊化，把hIL-10与微囊技术结合起来应用于胰岛移植治疗糖尿病的研究。方法：（1）制备微包囊，并对其性能进行检测。（2）从人外周血淋巴细胞中克隆hIL-10基因，在其5端添加鼠白蛋白信号肽核酸序列，将这段cDNA插入pcDNA3，构建hIL-10基因真核表达载体。（3）脂质体法转染c2c12细胞，经过G418药物筛选，挑单克隆得到了稳定表达hIL-10的c2c12／hIL-10细胞株，（4）c2c12／hIL-10细胞株微囊化制得微囊化基因工程细胞，观察微囊化c2c12／hIL-10细胞在体外的生长，并检测培养上清中hIL-10的分泌情况。结果：（1）微囊在机械强度，生物相容性，以及通透性方面均达到了移植的要求；（2）将真核表达载体进行测序，序列分析结果表明鼠白蛋白信号肽核苷酸序列的同源性达到96％，hIL-10核苷酸序列同源性为100％，并且读码框正确都为相同的氨基酸编码；（3）基因转染数周后，在RNA水平上检测到hIL-10基因；免疫组织化学检测到hIL-10蛋白表达，western blot检测到细胞培养上清液中有hIL-10蛋白表达分泌；（4）把c2c12／hIL-10细胞包微囊，western blot检测hIL-10能分泌到微囊外，MTT检测微囊化基因工程细胞体外增殖情况，结果表明微囊化并没有抑制细胞的增殖，只是在细胞增殖的起始阶段出现滞后。结论：正确的构建了hIL-10基因真核表达载体，并且得到了稳定表达hIL-10的c2c12／hIL-10细胞株，c2c12／hIL-10细胞微囊化后细胞在微囊中能够继续增殖，并且hIL-10能够分泌到微囊外发挥作用。