基于自溶素锚定的芽胞杆菌体内与体外活性展示系统的研究

论文摘要

芽胞杆菌（Bacillus）细胞表面展示系统是一种具有热稳定性的、可用于多种外源蛋白展示的生物技术平台。苏云金芽胞杆菌（B. thuringiensis）在芽胞杆菌属是仅次于模式种枯草芽胞杆菌（B. subtilis）的重要细菌种。该菌突出的特征是在形成芽胞的同时,能产生具有杀虫活性的伴胞晶体,目前已发展成重要的的杀虫细菌,同时也在表面展示多功能活性系统的应用方而展现出良好的应用潜力,成为发展细菌表面展示系统的优良宿主菌而在国内外受到重视。本研究利用一种芽胞杆菌细胞壁锚定蛋白作为运载蛋白,发展了一种从体内连续性展示于苏云金芽胞杆菌营养细胞和芽胞、体外展示于多种芽胞杆菌的营养细胞和芽胞的多重活性展示系统,并分别以绿色荧光蛋白和一种细菌突变漆酶作为目标蛋白进行了展示活性分析。这一多重活性的细菌表面展示系统目前在国内外尚未见报道。苏云金芽胞杆菌m坛是从野生菌株YBT-1520基因组中分析推定的,编码一种具有较强的细胞壁锚定结合性能的自溶素。本研究首先利用RT-PCR技术测定了该蛋白编码基因mbg在野生菌株中经连续7天培养周期中的相对转录活性量,结果显示mbg基因转录在菌体培养至约80%芽胞裂解时达到最高的活性值。通过对Mbg蛋白结构的预测,推断其是一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,其C端为催化结构域,N端是含有两个LysM的锚定结构域。为探索白溶素Mbg的N端结构域（Mbgn）作为表面展示体系中运载蛋白的活性,本研究通过将分别扩增得到的3个基因片段Pcry3Aa-mbgn-gfp连接到质粒载体pHT304上得到可在营养期起始表达融合蛋白Mbgn-GFP的重组质粒pMB164。经转化苏云金芽胞杆菌BMB171,筛选得到重组菌MB164。对重组菌MB164细胞的GFP特异荧光活性测定、免疫荧光显微镜观测和流式细胞仪分析测定结果表明,体内表达Mbgn-GFP融合蛋白不仅被高水平地锚定于营养细胞的表面,而且外源蛋白（GFP）是以其活性形式而展示于细胞表面。对重组菌MB164生长周期中各时期的GFP特异荧光活性进行了定时取样监测,结果表明在96h后（经显微镜观测,此时约70%芽胞被释放）,MB164的总荧光活性发生约33%的增加,而对照的MB165总荧光活性值发生约34%的减少,说明由Mbgn锚定的GFP可被展示于芽胞的表面。为了进一步验证和分析,构建融合蛋白的表达纯化载体pMB313,融合基因mbgn-gfp连接到pET22b（+）载体上。用纯化的融合蛋白Mbgn-GFP对细胞和芽胞进行体外的锚定实验,苏云金芽胞杆菌的营养体细胞荧光强度位能达到180,而其芽胞和枯草芽胞杆菌的营养体、芽胞都能达到140,并且这种体外锚定性能还在其它种类的革兰氏阳性菌中实现,证明了Mbgn锚定功能的广泛性。随后,用漆酶蛋白WlacD作为功能蛋白替代报告蛋白GFP构建了Mbgn-WlacD表面展示体系重组质粒命名为pMB316,转化苏云金芽胞杆菌得到重组菌MB316。对重组菌细胞的漆酶活性进行测定,MB316营养体酶活性可达10.56 U/ml远高于对照菌株BMB171（1.148 U/ml）,芽胞（4.648 U/ml）也具有一定活性。随后免疫荧光显微镜观测和流式细胞仪分析测定（Cy5荧光效率为33.43%）结果表明,体内表达Mbgn-WlacD融合蛋白不仅被高水平地锚定于营养细胞的表面,而且WlacD以其活性形式而展示于细胞表面同样使用纯化的融合蛋白对细胞和芽胞进行体外锚定,构建Mbgn-WlacD融合蛋白纯化载体,融合基因mbgn-wlacD连接至pTrcHisC,命名为pMB317。经Mbgn-WlacD纯化蛋白孵育的苏云金芽胞杆菌营养体酶活为2.74 U/ml（未孵育的仅为1.15 U/ml）、芽胞酶活性为1.86 U/ml（未孵育的为0.744 U/ml）,枯草芽胞杆菌的营养体（2.22 U/ml）和芽胞（1.72 U/ml）表面也检测到漆酶活性,再次证实了Mbgn作为运载蛋白具有的锚定功能的广泛性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 细菌表面展示技术与应用进展
• 1.1.1 表面展示技术的简介
• 1.1.2 细菌表面展示体系的组成
• 1.1.2.1 运载蛋白
• 1.1.2.2 靶蛋白
• 1.1.2.3 宿主菌
• 1.1.3 细菌表面展示技术的应用
• 1.1.3.1 疫苗开发
• 1.1.3.2 多肽文库的筛选
• 1.1.3.3 全细胞催化剂
• 1.1.3.4 生物吸附剂及降解剂
• 1.1.4 表面展示技术的问题及展望
• 1.2 细菌自溶素
• 1.2.1 自溶素概述
• 1.2.2 自溶素分类
• 1.2.2.1 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶
• 1.2.2.2 肽链内切酶和羧肽酶
• 1.2.2.3 N-乙酰胞壁酸
• 1.2.2.4 N-乙酰葡萄糖胺酶
• 1.2.3 细菌生活周期中的自溶素
• 1.3 LysM模体
• 1.3.1 LysM结构域概述
• 1.3.2 LysM的结构
• 1.3.3 含有LysM模体的多种功能蛋白
• 1.3.3.1 肽聚糖水解酶
• 1.3.3.2 噬菌体细胞溶解酶
• 1.3.3.3 其它蛋白
• 1.3.4 LysM模体的发展
• 1.4 漆酶的研究进展
• 1.4.1 漆酶概述
• 1.4.2 漆酶的性质
• 1.4.2.1 漆酶的理化性质
• 1.4.2.2 漆酶的结构及催化活性中心
• 1.4.2.3 漆酶催化的底物ABTS
• 1.4.2.4 漆酶活性的增强与抑制
• 1.4.4 漆酶的应用
• 1.4.4.1 食品行业的应用
• 1.4.4.2 在工业废水处理中的应用
• 1.4.4.3 在其它方面的应用
• 1.5 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.4 试剂
• 2.1.4.1 抽提质粒和总DNA、制备感受态
• 2.1.4.2 酶切、酶连、PCR和DNA回收
• 2.1.4.3 琼脂糖凝胶电泳、SDS-PAGE及Western blot
• 2.1.4.4 显微镜观察及流式细胞仪分析所用试剂
• 2.1.4.5 SDS及Pronase敏感性分析试剂
• 2.1.4.6 大肠杆菌表达、纯化所需试剂
• 2.1.4.7 漆酶活性测定试剂
• 2.1.4.8 其它缓冲液及试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 常规分子生物学操作技术
• 2.2.1.1 大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌质粒DNA抽提
• 2.2.1.2 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提
• 2.2.1.3 DNA电泳分析及回收
• 2法转化'>2.2.1.4 酶连与大肠杆菌的CaCl₂法转化
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.4 绿色荧光蛋白荧光强度检测
• 2.2.5 生长曲线及荧光活性曲线绘制
• 2.2.6 苏云金芽胞杆菌细胞成分的分级分离
• 2.2.7 SDS-PAGE及Western Blot分析
• 2.2.7.1 SDS-PAGE分析
• 2.2.7.2 Western blot分析
• 2.2.8 相差及荧光显微镜观察
• 2.2.9 流式细胞仪分析
• 2.2.10 大肠杆菌诱导表达、亲和纯化
• 2.2.10.1 大肠杆菌诱导表达
• 2.2.10.2 亲和纯化
• 2.2.11 漆酶酶活性的测定
• 2.2.12 相对荧光定量
• 3 结果与分析
• 3.1 mbg基因表达分析
• 3.1.1 mbg在苏云金芽胞杆菌不同菌种中的扩增
• 3.1.2 mbg坛基因在细菌不同生长时期的转录活性
• 3.2 Mbgn-GFP表面展示体系构建及分析
• 3.2.1 Mbgn-GFP表面展示体系构建
• 3.2.2 生长曲线及荧光强度曲线绘制
• 3.2.3 荧光显微镜及免疫荧光显微镜观察
• 3.2.4 流式细胞仪分析
• 3.3 Mbgn-GFP融合蛋白的纯化与体外锚定
• 3.3.1 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 3.3.2 Mbgn-GFP对不同菌株的体外锚定能力分析
• 3.4 Mbgn-WlacD表而展示体系构建
• 3.4.1 Mbgn-WlacD表面展示体系构建
• 3.4.2 重组菌漆酶活性测定
• 3.4.3 生长曲线及酶活曲线的绘制
• 3.4.4 免疫荧光显微镜观察
• 3.4.5 流式细胞仪分析
• 3.5 Mbgn-WlacD融合蛋白的表达
• 3.5.1 融合蛋白表达载体的构建与诱导
• 3.5.2 融合蛋白体外锚定能力分析
• 3.6 Mbg蛋白的纯化
• 3.6.1 Mbg纯化载体的构建
• 3.6.2 Mbg蛋白的诱导
• 4. 讨论
• 4.1 Mbg的功能分析
• 4.2 Mbg的锚定能力分析
• 4.4. 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录