嗜热细菌木糖异构酶的分子改造及纤维堆囊菌xylA的克隆与表达

论文摘要

燃料乙醇是最有发展前景的新型可再生能源，其生产和应用因在经济发展和战略安全上的重大意义，越来越受到各国政府的重视。自然界中含有丰富的植物纤维资源，而目前只有3-4％的植物纤维资源被有效地利用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，实现木糖转化乙醇是纤维素乙醇生产需要解决的难题之一。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是传统上食品及化工工业的最佳生产菌株，在工业生产中有上百年的酒类发酵应用历史，具有乙醇产量高、抗逆性强等许多优良特性，是乙醇工业生产的首选菌株。然而酿酒酵母菌缺乏转化木糖生成木酮糖的酶而不能利用木糖，但能利用木糖的异构体形式——木酮糖。 根据代谢途径工程理论，采用代谢流扩增和底物谱拓展的所谓“加法战略”，重组表达木糖向木酮糖转化所需的相关酶基因，是在酿酒酵母中建立木糖代谢途径的有效措施。木糖异构酶（xylose isomerase Ⅺ）能直接转化木糖生成木酮糖，不需要任何辅因子，被认为是在酿酒酵母建立木糖代谢的首选途径。但迄今为止只有三种来源的木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中得到活性表达，由于它们在酵母发酵温度30℃条件下的酶活性相对比较低，还不能适应乙醇发酵的要求。 本论文主要包括两个方面，一方面对已经在酿酒酵母中得到活性表达的嗜热细菌Thermus thermophilus木糖异构酶Ⅺ进行分子改造，以提高其在酵母发酵温度下的酶活性；另一方面，克隆中温型嗜纤维素粘细菌纤维堆囊菌Sorangium cellulosum的木糖异构酶基因xylA并在酿酒酵母中得到活性表达。 在相关文献研究结果的基础上，对一系列木糖异构酶氨基酸序列进行比对，同时分析了T．thermophilus木糖异构酶的三维结构；选择两个氨基酸残基位点Pro137和Asp247突变成Gly。通过定点突变获得三个突变体Ⅺ137（Pro137Gly）、Ⅺ247（Asp247Gly）、Ⅺ137247（Pro137Gly，Asp247Gly），并构建表达载体XM204-Ⅺ137、XM204-Ⅺ247和XM204-Ⅺ137247，转化实验室酿酒酵母H158，得到重组菌株H158-Ⅺ137、H158-Ⅺ247和H158-Ⅺ137247，然后对重组菌株进行酶活性分析。结果显示：相对于野生型的Ⅺ，突变体Ⅺ137、Ⅺ247和Ⅺ137247中温条件下的酶活性有所提高，特别30℃的酶活比原初Ⅺ提高一倍；最适pH范围有很大的拓展，在pH6.0-9.0之间都能表现出很高的酶活性；但是，突变体

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 本文缩写词表
• 第一章 前言
• 1.1 充分利用纤维素资源的重大意义
• 1.2 木质纤维素及其利用
• 1.3 木糖异构酶（xylose isomerase,Ⅺ）
• 1.3.1 木糖的Ⅺ代谢途径
• 1.3.2 木糖异构酶的概念
• 1.3.3 木糖异构酶的理化性质
• 1.3.4 木糖异构酶的分类及比较
• 1.3.5 嗜热细菌的木糖异构酶
• 1.4 酿酒酵母
• 1.4.1 酿酒酵母生产乙醇的研究
• 1.4.2 Ⅺ木糖代谢途径在酿酒酵母中的建立
• 1.5 蛋白质的分子改造
• 1.6 纤维堆囊菌
• 1.6.1 纤维堆囊菌的主要特性
• 1.6.2 纤维堆囊菌的研究现状
• 1.7 本文的研究工作
• 第二章 嗜热细菌（T.thermophilus）木糖异构酶的分子改造
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 分子克隆用酶和试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 微生物学技术
• 2.1.5 分子生物学方法
• 2.1.6 粗酶液的制备
• 2.1.7 酶活测定方法
• 2.1.8 最适pH测定方法
• 2.1.9 热稳定性测定方法
• 2.1.10 蛋白质含量的测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 定点突变位点的选择
• 2.2.2 定点突变体的获得与鉴定
• 2.2.3 突变体质粒表达载体的构建
• 2.2.4 重组酿酒酵母菌株的获得
• 2.2.5 H158-Ⅺ和H158-Ⅺm最适反应温度的测定
• 2.2.6 H158-Ⅺ和H158-Ⅺm最适pH的测定
• 2.2.7 H158-Ⅺ和H158-Ⅺm热稳定性的测定
• 2.2.8 突变体Ⅺ137结果分析
• 2.2.9 突变体Ⅺ247结果分析
• 2.2.10 双突变体Ⅺ137247结果分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因的克隆与表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 引物
• 3.1.3 分子克隆用酶和试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 微生物学技术
• 3.1.6 分子生物学方法
• 3.1.7 粗酶液的制备
• 3.1.8 酶活测定方法
• 3.1.9 蛋白质含量的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 纤维堆囊菌木糖异构酶的酶活测定
• 3.2.2 纤维堆囊菌染色体的提取
• 3.2.3 纤维堆囊菌xylA基因保守区域的克隆与分析
• 3.2.4 纤维堆囊菌157-2基因组的酶解与杂交结果
• 3.2.5 纤维堆囊菌157-2特异性杂交片段的回收
• 3.2.6 反向PCR结果及序列分析
• 3.2.7 纤维堆囊菌157-2 xylA全长的克隆
• 3.2.8 纤维堆囊菌157-2的Ⅺ表达载体的构建
• 3.2.9 纤维堆囊菌157-2的Ⅺ重组菌株的构建
• 3.2.10 纤维堆囊菌157-2的Ⅺ酶活性质的初步研究
• 3.3 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表