论文摘要
乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤,在发达国家及我国的一些大型工业化城市,乳腺癌的发病率已居女性恶性肿瘤的首位。目前,手术、化疗和放疗仍是乳腺癌的主要治疗手段,但是都存在一定的局限性。通过这些方法的综合治疗后,乳腺癌患者的五年生存率仍不十分理想;因此,探讨新的治疗方法和措施已刻不容缓。近年来,肿瘤的生物治疗发展迅速,已成为肿瘤治疗的新亮点。其中肿瘤免疫治疗不仅能提高宿主免疫能力,特异性杀伤肿瘤细胞,而且对正常组织细胞毒副作用甚微。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要途径,是一个由多种免疫细胞和细胞因子参与的复杂过程。肿瘤发生与转移的重要原因是机体免疫系统清除非己成分的能力减弱,使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视,机体不能产生针对肿瘤的免疫反应。肿瘤免疫治疗的目标是提高肿瘤细胞的免疫原性,加强机体免疫系统对肿瘤的识别和清除能力。细胞因子是免疫调节的重要因素,可以活化免疫细胞,增强免疫细胞的功能,有的细胞因子甚至可以直接杀伤肿瘤细胞。但是,细胞因子在临床上并没有被得到广泛应用,主要原因是多数细胞因子有不同程度的毒副作用,受给药剂量的限制,很难达到有效的治疗浓度,因此,对肿瘤的治疗效果不佳;另外,外源性细胞因子在机体内半衰期短,因不易维持有效治疗浓度,需要多次给药,不仅造成经济上的大量支出,而且易造成严重毒副作用。而通过载体,将细胞因子基因导入肿瘤细胞,使其表达细胞因子,在肿瘤局部发挥抗肿瘤作用,另外,肿瘤细胞可提供肿瘤抗原,刺激机体产生特异性免疫反应,杀伤肿瘤细胞,这是一种比较理想的治疗方法,也是目前研究的热点。白细胞介素23（interleukin23,IL-23）是Oppmann等于2000年发现的一种异二聚体细胞因子,可促进记忆性T细胞增殖,诱导活化的T细胞和树突状细胞产生干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）等细胞因子,具有较强的免疫调节活性,参与自身免疫性疾病、慢性炎症反应和某些感染性疾病的发病和调控[1]。有报道提出,IL-23可通过诱导和增强小鼠脾细胞CTL活性和IFN-γ等细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用。因此,IL-23作为肿瘤基因治疗的候选因子越来越受到关注。但大部分文献是IL-23在炎症反应中作用的报道,关于其抗肿瘤作用的报道甚少,且其作用机理仍不十分清楚。本研究旨在探讨IL-23基因对小鼠乳腺癌细胞的体内外抑瘤作用及其作用机理,为乳腺癌的基因治疗提供实验和理论依据。本实验共分为四个部分:第一部分表达小鼠IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞MA-891/IL-23的建立目的:用逆转录病毒作为载体将小鼠IL-23（mIL-23）基因导入小鼠乳腺癌细胞（MA-891）,建立能分泌具有生物学活性IL-23的肿瘤细胞株（IL-23/MA-891）,探讨外源性IL-23基因对MA-891细胞生长及其生物学性状的影响,为深入研究IL-23在小鼠乳腺癌中的作用奠定基础。方法:应用逆转录病毒载体LXSN,将插入IL-23基因的质粒感染ψ2（ecotropic）和PA317（amphotropic）两种包装细胞,经G418筛选后获得表达IL-23分子的PA317阳性细胞克隆,用IL-23/PA317培养上清转染MA-891细胞。用RT-PCR技术检测MA-891细胞中目的基因的表达;用ELISA法检测IL-23/MA-891分泌IL-23的能力,同时筛选出高表达IL-23的IL-23/MA-891细胞克隆;用免疫细胞化学染色法检测MA-891、LXSN/MA-891及IL-23/MA-891细胞中IL-23蛋白的表达;采用流式细胞仪检测不同MA-891细胞中MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80和CD86以及Fas蛋白的表达,同时检测三种细胞的细胞凋亡情况;用ELISA法检测IL-23/MA-891细胞培养上清诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力,用MTT比色法检测细胞增殖反应。结果:1携带IL-23基因的逆转录病毒载体ψ2细胞包装的逆转录,再经PA317细胞包装产生高滴度病毒（病毒滴度为3-5×105CFU/ml）,而且PA317/IL-23细胞有mIL-23 mRNA的表达,培养上清中能检测到mIL-23（30.0±2.0 pg/ml）,其分泌的逆转录病毒可用于转染肿瘤细胞。2外源性IL-23基因（PA317/IL-23细胞培养液）转染的小鼠乳腺癌细胞系IL-23/MA-891,经RT-PCR以及细胞免疫组化证实,在mRNA水平和蛋白水平均可获得稳定表达。3在Con A作用下,IL-23/MA-891细胞培养上清可诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ（28.5±2.7 ng/L）,其水平明显高于LXSN/MA-891和MA-891细胞培养上清所诱导产生的IFN-γ含量（分别为5.1±0.3 ng/L和4.7±0.6 ng/L）（p<0.01）。4体外培养的IL-23/MA-891细胞形态和生长速度与LXSN/MA-891和MA-891细胞无明显差异;经流式细胞仪检测,三者间的细胞凋亡率亦无显著性差异（P>0.05）;细胞表面的MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80、CD86以及Fas蛋白的表达水平也无显著性差异（P>0.05）;经MTT检测,IL-23/MA-891细胞的增殖反应与LXSN/MA-891和MA-891细胞相比虽有所降低,但无显著性差异（P>0.05）。小结:成功建立表达小鼠IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞系（IL-23/MA-891）;导入IL-23基因后,对MA-891细胞的形态、体外增殖活性以及表面分子的表达均无显著影响。第二部分IL-23/MA-891细胞在小鼠体内的致瘤性及其对小鼠免疫功能的影响目的:研究IL-23/MA-891细胞在小鼠体内的致瘤性及其对免疫功能的调节作用。方法:将转染IL-23基因的IL-23/MA-891细胞、转染逆转录病毒空载体的LXSN/MA-891细胞以及野生型MA-891细胞分别接种于小鼠皮下,观察在小鼠体内的肿瘤生长情况;30天时分别取三组小鼠脾脏和肿瘤组织,用乳酸脱氢酶法、[3H]-TdR掺入法分别检测三组脾细胞CTL杀伤活性、脾细胞增殖反应情况。用流式细胞仪检测脾细胞CD11c分子的表达来反映树突状细胞（DC）的数量。用ELISA法检测小鼠脾细胞经MA-891细胞刺激后,IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的产生情况;用流式细胞仪检测肿瘤组织细胞MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子、CD80、CD86的表达变化,并检测脾细胞中CD4+、CD8+ T淋巴细胞比率;用免疫组织化学技术对三组肿瘤组织中CD4、CD8阳性T淋巴细胞浸润情况进行检测。结果:1 IL-23基因转染组与空载体转染组及野生型MA-891细胞在小鼠体内的成瘤率均为100%,但IL-23基因转染组MA-891细胞在小鼠皮下生长速度明显慢于接种空载体转染组及未转染组。2接种IL-23/MA-891细胞后30天时,小鼠脾细胞的CTL杀伤活性明显高于接种PBS对照组小鼠（p<0.01）。3接种IL-23/MA-891细胞组小鼠脾细胞对Con A或LPS刺激的增殖反应性显著高于接种LXSN/MA-891细胞和MA-891细胞小鼠的脾细胞（p<0.01）,而接种LXSN/MA-891细胞组小鼠脾细胞的增殖反应与接种MA-891细胞组小鼠脾细胞比较无明显不同。4接种IL-23/MA-891细胞小鼠的脾细胞可产生高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12等Th1类及相关细胞因子,明显高于接种LXSN/MA-891细胞和MA-891细胞小鼠的脾细胞,有非常显著性差异（P<0.01）,而Th2类细胞因子IL-4的产生水平,三者之间无显著性差异（P>0.05）。5接种IL-23/MA-891细胞组小鼠的脾细胞中CD11c阳性细胞率、CD4+T细胞及CD8+T细胞比率均较接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组小鼠显著增高（P<0.01）。6经免疫组化检测,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中CD4+、CD8+ T细胞浸润数量,阳性细胞比率均较接种MA-891和LXSN/MA -891细胞组小鼠的肿瘤组织明显增加（P<0.01）。7接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织细胞MHCⅠ和MHCⅡ类分子以及CD80、CD86分子的表达水平显著性增高（P<0.01）。小结:转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞所分泌的IL-23具有生物学活性,在小鼠体内发挥了较强的抗肿瘤作用。通过促进CD4+Th1细胞产生细胞因子、增加CD8+T细胞的数量及功能、增加树突状细胞的数量以及肿瘤的抗原性、抗原提呈协同刺激作用,从而增强细胞免疫功能,发挥抗肿瘤作用。第三部分转染IL-23基因对MA-891细胞凋亡的影响及其作用机制研究目的:探讨IL-23基因转染是否对MA-891细胞凋亡产生影响,并初步探讨其相关的作用机制,为进一步研究IL-23的抗肿瘤作用奠定基础。方法:分别取接种IL-23/MA-891、LXSN/MA-891、MA-891细胞30天时的小鼠肿瘤组织,制成单细胞悬液,用流式细胞仪检测三组肿瘤细胞的凋亡率;应用TUNEL法检测三组肿瘤组织细胞原位凋亡;应用电镜观察各组肿瘤组织细胞凋亡的超微结构变化;同时应用RT-PCR法、Western-blot法以及免疫组化法检测三组肿瘤组织中Fas和Survivin的表达情况。结果:1流式细胞仪检测结果显示,体外培养的IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891细胞的凋亡率无明显差异（P>0.05）。然而,将这三种肿瘤细胞分别接种于津白Ⅱ号小鼠后第30天时,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织细胞的凋亡率（37.3±1.2%）明显高于接种LXSN/MA-891（18.7±0.5%）和MA-891细胞组（18.4±1.3%）小鼠（p<0.01）。2 TUNEL法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组肿瘤组织内发现灶性分布的凋亡细胞,细胞核内有棕色颗粒,接种LXSN/MA-891细胞组和MA-891细胞组肿瘤组织仅见极少数散在分布的凋亡细胞。接种IL-23/MA-891细胞组肿瘤细胞的凋亡率为（39.0±1.0%）,明显高于接种LXSN/ MA-891（11.6±1.2%）和MA-891细胞组（11.1±0.9%）（P<0.01）。3电子显微镜观察可见,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠瘤组织细胞呈典型的凋亡细胞形态,表现为线粒体大部分嵴和膜融合和消失,细胞质内有空泡变性。细胞核膜破损缺失,核质生成许多碎块散落在细胞质内,并可见凋亡小体形成。而接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组小鼠肿瘤组织细胞核大、核畸形明显,表面为绒毛、细胞器呈典型的肿瘤细胞形态,未发现凋亡征象。4 RT-PCR法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中Fas mRNA表达水平明显高于接种LXSN/MA-891细胞和MA-891细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。而Survivin mRNA在接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中的表达水平则明显低于接种LXSN/MA-891细胞和MA-891细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。5 Western-blot法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中Fas蛋白表达水平明显高于接种LXSN/MA-891细胞和野生型MA-891细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。而在接种IL-23/MA-891细胞组小鼠瘤组织中的Survivin蛋白表达水平则明显低于接种LXSN/MA- 891细胞和MA-891细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。6免疫组化法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中Fas的阳性积分（1.51）明显高于接种LXSN/MA-891（0.62）和MA-891（0.60）细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。而Survivin在接种IL-23/MA-891细胞组小鼠瘤组织中的阳性积分（0.52）则明显低于接种LXSN/MA-891 （1.44）和MA-891（1.34）细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。小结:转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞所分泌的IL-23可能通过增加细胞表面Fas的表达、降低Survivin的表达,直接或间接的促进小鼠乳腺癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。第四部分转染IL-23基因对荷瘤小鼠乳腺癌组织血管生成的影响目的:探讨IL-23基因转染对荷瘤小鼠乳腺癌组织中血管生成的影响,研究IL-23是否具有抗肿瘤血管生成的作用,并探讨其相关作用机制。方法:分别取接种IL-23/MA-891、LXSN/MA-891、MA-891细胞30天时的小鼠肿瘤组织,采用RT-PCR法以及免疫组化法检测三组小鼠肿瘤组织中VEGF的表达;通过免疫组化法检测三组肿瘤组织中CD34的表达情况,计算三组肿瘤组织中的MVD值。结果:1免疫组化法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中VEGF的表达水平明显低于接种LXSN/MA-891和MA-891细胞组小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。2同样,经RT-PCR法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中VEGF mRNA表达水平明显低于接种LXSN/MA-891细胞和MA-891细胞组小鼠的瘤组织（P<0.01）。3免疫组化法检测结果显示,接种IL-23/MA-891细胞组小鼠肿瘤组织中CD34阳性的微血管计数（MVD）为18.23±6.92,明显低于接种LXSN/MA-891（36.13±10.40）和MA-891细胞组（38.16±12.30）小鼠的肿瘤组织（P<0.01）。小结:转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞在荷瘤小鼠体内通过分泌IL-23,可能通过降低细胞VEGF的表达,抑制肿瘤微血管生成,从而发挥抗肿瘤作用。
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