论文题目: 核黄素营养酵母生产菌株的选育及培养条件研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 李长文
导师: 肖冬光
关键词: 核黄素,酵母,诱变育种,分批培养,流加培养
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文依据核黄素在酵母胞内的代谢途径及代谢控制理论,研究了高核黄素含量的营养酵母菌种的选育及其培养条件。主要研究内容和结果如下: （1）通过对分光光度法、荧光光度法和高效液相色谱法三种核黄素测定方法的研究和比较,确定了荧光光度法为酵母胞内核黄素含量测定的适宜方法。测定条件为:激发波长458nm、发射波长525nm,用连二亚硫酸钠专一性地猝灭核黄素的荧光,消除了其他荧光物质对测定的影响,响应值与含量之间有良好的线性关系,重现性好、准确度高。 （2）以脆壁酵母RY-3作为出发菌株,对其营养体及原生质体进行紫外线诱变处理。通过初筛、复筛、性能检验、连续传代,筛选得到具有8-氮鸟嘌呤抗性和寡霉素抗性的突变株19株。RY605、RY606、RY618三株突变株生长周期比出发菌株明显缩短,胞内核黄素含量分别比出发菌株提高了79.97%、69.56%、71.09%,经传代试验证明三菌株遗传稳定。 （3）以诱变所得到的突变株RY605和阿舒假囊酵母（E.ashybii）作为亲株进行原生质体融合,两亲株原生质体的形成条件为:RY605采用2%蜗牛酶,30℃下酶解60min;E.ashybii采用1%纤维素酶加2%蜗牛酶,30℃下酶解120min。灭活后的亲株原生质体在35%PEG-6000溶液中进行融合60min,融合子FY309的核黄素含量达到87.86mg/kg,比亲株RY605提高了15.27%。 （4）研究不同发酵条件对酵母的生长及对核黄素含量的影响,通过单因子试验和均匀设计试验,确定了摇瓶培养的最优培养基配方为:葡萄糖40g/L,硫酸铵3.5g/L,酵母粉5g/L,生物素100μg/L,硫胺素1.5mg/L,MgSO4·7H2O 1.1g/L,CoSO4·7H2O 28mg/L,CuSO4·5H2O 0.01mg/L,MnCl20.02mg/L,ZnSO4·7H2O 34mg/L,FeSO4·7H2O 14mg/L。摇瓶分批培养的最佳条件为:培养基初始pH值5.5,500mL三角瓶内培养基装液量60mL,30℃、180r/min下振荡培养,酵母生长达到稳定期时收获。 （5）通过对流加培养过程中溶氧浓度、发酵液pH值、发酵液葡萄糖浓度等因素对发酵的影响进行研究,发现在酵母的流加培养中,适宜的培养条件为相对溶氧浓度20%,发酵液pH值控制在5.5,发酵液葡萄糖浓度控制在1g/L～5g/L范围内,酵母生长速度快,生物量大。酵母种子中核黄素含量与酵母产品中的核黄素含量成正相关,生产中应尽可能地提高种子胞内核黄素含量。流加培养结束前进行温度休克处理,可以提高酵母胞内核黄素含量,可以达到102.41mg/kg。 本论文在核黄素营养酵母研究方面的创新之处在于,首次对酵母胞内核黄素的积累规律进行了研究,研究了酵母在摇瓶分批培养和流加培养中胞内核黄素含量随酵母生长的变化规律,发酵条件对酵母生长及核黄素含量的影
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 核黄素概述
1.2 核黄素的生理作用和医学作用
1.2.1 参与机体的能量代谢
1.2.2 参与碳水化合物的代谢
1.2.3 核黄素可改善缺铁性贫血
1.2.4 核黄素预防心脑血管疾病
1.2.5 核黄素的防癌作用
1.2.6 核黄素提高人体对恶劣环境的适应力
1.2.7 不同人群对核黄素的需求量
1.3 核黄素的研究与生产概况
1.3.1 核黄素的生物合成代谢途径
1.3.2 发酵法生产核黄素的微生物
1.3.2.1 阿舒假囊酵母
1.3.2.2 棉病阿舒囊霉
1.3.2.3 酿酒酵母
1.3.2.4 假丝酵母
1.3.2.5 枯草杆菌
1.3.3 基因工程在核黄素生产菌改造中的应用
1.4 营养酵母的研究进展
1.4.1 酵母的营养意义
1.4.2 食用酵母概念及产品种类
1.4.2.1 按酵母菌种来源分类
1.4.2.2 按产品形状分类
1.4.2.3 按酵母的营养功能或培养方法分类
1.4.3 食用酵母的营养价值
1.4.4 国内外食用酵母的生产与研究概况
1.4.4.1 国内外研究现状
1.4.4.2 食用酵母的生产方法
1.5 酵母胞内核黄素的测定方法
1.5.1 分光光度法
1.5.2 荧光光度法
1.5.2.1 直接荧光法
1.5.2.2 光黄素测定法
1.5.3 液相色谱法
1.6 酵母胞内核黄素的合成代谢
1.7 本论文的立题依据和研究内容
1.7.1 立题依据
1.7.2 研究内容
1.7.2.1 酵母胞内核黄素测定方法研究
1.7.2.2 生产菌株的确定与改良
1.7.2.3 发酵培养基优化
1.7.2.4 发酵条件优化
1.7.2.5 在5L发酵罐中流加培养条件研究
参考文献
第二章 酵母胞内核黄素含量测定方法的研究
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要溶液
2.3 实验方法
2.3.1 样品的提取与制备
2.3.2 分光光度法测定核黄素含量
2.3.3 荧光光度法测定核黄素含量
2.3.4 高效液相色谱法测定核黄素含量
2.4 结果与讨论
2.4.1 酵母中核黄素提取方法的确定
2.4.2 荧光检测条件的确定
2.4.2.1 发射光波长的确定
2.4.2.2 激发光波长的确定
2.4.3 高效液相色谱条件的确定
2.4.3.1 流动相浓度的确定
2.4.3.2 流动相流速的确定
2.4.4 标准曲线的绘制
2.4.4.1 分光光度法
2.4.4.2 荧光光度法
2.4.4.3 高效液相色谱法
2.4.5 不同测定方法加标回收率的研究
2.4.6 不同测定方法重现性与准确率的研究
2.5 小结
参考文献
第三章 核黄素酵母菌的诱变育种
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌种
3.2.2 主要仪器
3.2.3 主要试剂
3.2.4 相关溶液
3.2.4.1 柠檬酸-磷酸缓冲液(CPB)
3.2.4.2 巯基乙醇
3.2.4.3 去壁酶液
3.2.5 培养基
3.2.5.1 种子培养基
3.2.5.2 发酵培养基
3.2.5.3 酵母基本固体培养基
3.2.5.4 YEPD固体培养基
3.2.5.5 高渗YEPD固体培养基
3.2.5.6 8-氮鸟嘌呤抗性筛选培养基
3.2.5.7 寡酶素抗性筛选培养基
3.3 实验方法
3.3.1 菌体生长曲线的测定
3.3.2 原生质体制备
3.3.3 致死曲线的绘制
3.3.4 诱变方法
3.3.5 8-氮鸟嘌呤抗性突变株的筛选
3.3.6 寡酶素抗性突变株的筛选
3.3.7 性能检测
3.3.8 分析方法
3.3.8.1 胞内核黄素的测定
3.3.8.2 酵母核酸含量测定
3.3.8.3 酵母粗蛋白含量测定
3.3.8.4 酵母自溶率的测定
3.3.8.5 葡萄糖测定
3.4 结果与讨论
3.4.1 出发菌株的选择
3.4.1.1 6株酵母菌的生长曲线
3.4.1.2 不同酵母菌胞内核黄素含量
3.4.1.3 不同酵母菌生物量
3.4.1.4 核酸及蛋白质含量
3.4.1.5 不同酵母菌的自溶率
3.4.2 致死曲线绘制与诱变剂量选择
3.4.3 出发菌株药物抗性检验
3.4.4 抗性突变株的选育
3.4.5 发酵性能检测
3.5 本章小结
参考文献
第四章 核黄素营养酵母的原生质体融合育种
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌种
4.2.2 主要仪器
4.2.3 主要试剂
4.2.4 培养基
4.2.4.1 产孢培养基
4.2.4.2 药物梯度培养基
4.2.4.3 高渗固体再生培养基
4.2.4.4 高渗半固体再生培养基
4.2.4.5 药物抗性筛选培养基
4.2.4.6 YPD固体平板
4.2.5 主要溶液
4.2.5.1 核黄素标准液
4.2.5.2 柠檬酸-磷酸缓冲液(CPB)
4.2.5.3 巯基乙醇
4.2.5.4 去壁酶液
4.2.5.5 促融合剂
4.3 实验方法
4.3.1 亲株的产孢试验
4.3.2 菌体生长曲线测定
4.3.3 原生质体形成条件确定
4.3.4 原生质体再生
4.3.5 原生质体形成率与再生率的计算
4.3.6 原生质体药物抗性检验
4.3.7 原生质体灭活
4.3.7.1 原生质体紫外灭活
4.3.7.2 原生质体的热灭活
4.3.8 原生质体融合
4.3.8.1 单亲灭活原生质体融合
4.3.8.2 亲灭活原生质体融合
4.3.9 融合菌株的筛选及性能检验
4.3.10 融合子遗传稳定性研究
4.4 结果与讨论
4.4.1 单倍体亲株的生长曲线
4.4.2 原生质体制备条件的确定
4.4.2.1 β-巯基乙醇处理对原生质体形成及再生的影响
4.4.2.2 酶的种类对原生质体形成的影响
4.4.2.3 酶浓度对原生质体形成及再生的影响
4.4.2.4 酶解温度的影响
4.4.2.5 酶解时间的影响
4.4.2.6 亲株及原生质体的形态
4.4.3 亲株原生质体药物抗性检验
4.4.4 亲株原生质体致死条件的研究
4.4.5 原生质体融合
4.4.5.1 Ca~(2+)浓度对融合率的影响
4.4.5.2 PEG作用时间对融合率的影响
4.4.5.3 单亲灭活原生质体融合
4.4.5.4 双亲灭活原生质体融合
4.4.5.5 融合子的性能检验
4.5 本章小结
参考文献
第五章 核黄素营养酵母培养基及培养条件优化
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 菌种
5.2.2 主要仪器
5.2.3 主要试剂
5.2.4 培养基
5.2.4.1 斜面活化培养基
5.2.4.2 种子培养基
5.2.4.3 糖蜜培养基
5.2.4.4 发酵培养基
5.3 实验方法
5.3.1 种子活化
5.3.2 种子培养
5.3.3 发酵培养
5.3.4 B-P析因实验设计
5.3.5 金属离子的影响——均匀设计
5.3.6 分析方法
5.4 结果与讨论
5.4.1 核黄素生成与酵母生长的关系
5.4.2 酵母生长及核黄素合成的影响因素筛选
5.4.3 氮源适应性实验
5.4.4 生物素对发酵的影响
5.4.6 硫胺素对发酵的影响
5.4.7 金属离子对酵母生长及核黄素含量的影响
5.4.8 培养基初始pH值对酵母生长及核黄素合成的影响
5.4.9 溶氧水平对酵母生物量及核黄素合成的影响
5.4.9.1 不同转速对酵母生长及核黄素含量的影响
5.4.9.2 不同装液量对酵母生长及核黄素含量的影响
5.4.10 添加豆油对胞内核黄素的影响
5.5 本章小结
参考文献
第六章 5L发酵罐流加培养过程及发酵动力学研究
6.1 引言
6.2 实验材料
6.2.1 菌种
6.2.2 主要仪器
6.2.3 主要试剂
6.2.4 相关溶液
6.2.4.1 0.1mol／LNa_2S_2O_3标准溶液
6.2.4.2 0.05mol／LI_2标准溶液
6.2.4.3 0.2％淀粉指示剂
6.2.4.4 亚硫酸钠溶液
6.2.4.5 发酵基液
6.2.4.6 营养盐溶液
6.2.5 培养基
6.3 实验方法
6.3.1 溶氧系数的测定
6.3.2 种子培养及活化
6.3.3 流加培养
6.3.4 测定方法
6.4 结果与讨论
6.4.1 体积溶氧系数的测定
6.4.2 不同溶氧水平对酵母胞内核黄素含量的影响
6.4.3 不同pH值对酵母胞内核黄素含量的影响
6.4.4 添加豆油对酵母胞内核黄素含量的影响
6.4.5 不同糖浓度对酵母生长即核黄素含量的影响
6.4.6 种子质量对酵母生长及核黄素含量的影响
6.4.7 酵母胞内核黄素的生成与酵母生长的关系
6.4.7.1 摇瓶培养中酵母胞内核黄素生成与酵母生长的关系
6.4.7.2 流加培养中酵母的生长与核黄素的生成
6.4.8 温度休克对酵母核黄素含量的影响
6.5 本章小结
参考文献
第七章 全文总结与展望
7.1 全文总结
7.1.1 酵母胞内核黄素含量的测定方法研究
7.1.2 酵母营养体及原生质体诱变选育高核黄素含量菌种
7.1.3 原生质体融合选育高核黄素含量酵母菌种
7.1.4 发酵培养基及发酵条件优化研究
7.1.5 5L发酵罐流加培养过程及发酵条件研究
7.2 本论文创新点
7.3 展望
致谢
攻读博士期间发表论文
发布时间: 2007-01-10
参考文献
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